Tsien, Roger

Roger Tsien
Englanti  Roger Tsien
Syntymäaika 1. helmikuuta 1952( 1952-02-01 ) [1] [2] [3] […]
Syntymäpaikka
Kuolinpäivämäärä 24. elokuuta 2016( 24.8.2016 ) [1] [2] [3] […] (64-vuotias)
Kuoleman paikka
Maa
Tieteellinen ala biokemia
Työpaikka UC Berkeley
UC San Diego
Alma mater Harvardin yliopisto
Cambridgen yliopisto
tieteellinen neuvonantaja Richard Adrian
Jeremy Sanders
Palkinnot ja palkinnot susipalkinto icon.png Wolfin lääketieteen palkinto (2004) Nobelin kemian palkinto ( 2008 )
Nobel palkinto
Verkkosivusto tsienlab.ucsd.edu
 Mediatiedostot Wikimedia Commonsissa

Roger Tsien ( Roger Qian , englanniksi  Roger Tsien , Chinese 钱永健, pinyin Qián Yǒngjiàn , pall. Qian Yongjian [4] ; 1. helmikuuta 1952  - 24. elokuuta 2016 ) - kiinalaista alkuperää oleva amerikkalainen kemisti, kemian laitoksen professori ja Kalifornian biokemian yliopisto San Diegossa [5] . Vuonna 2008 hänelle myönnettiin kemian Nobel-palkinto " vihreän fluoresoivan proteiinin löytämisestä ja työstä " yhdessä kahden muun kemistin kanssa [6] .

Elämäkerta

Varhaiset vuodet

Roger Yongchin Tsien syntyi New Yorkissa 1. helmikuuta 1952 nuorimpana kolmesta pojasta Xuezhu Tsienille, joka on koneinsinööri Massachusetts Institute of Technologysta ja sairaanhoitaja Ying. Hänen perheensä sukujuuret liittyvät Hangzhousta kotoisin olevien oppineiden aatelisten linjaan , jolla on pitkä historiallisesti dokumentoitu suhde Song-dynastiaan . Lisäksi perheellä oli epätavallinen kohtalo, joka heijastaa Kiinan historiallisia tapahtumia toisen maailmansodan aikana ja välittömästi sen jälkeen. Sen edustajat tekivät usein uran lännessä epäonnistumisista ja ennakkoluuloista huolimatta. Joten Qian Xuesen , yksi California Institute of Technologyn Jet Propulsion Laboratoryn perustajista , on Tsienin isän serkku. Tsienin veli Richard on myös tunnettu Stanfordin tutkija. Roger sanoi kerran:

"Olen syntynyt tähän työhön."

Rogerin isä omisti pienen kauppayhtiön New Yorkissa ja työskenteli myös suunnittelukonsulttina Westchesterin piirikunnassa. Hänen isänsä muutti sitten perheen Livingstoniin, New Jerseyyn, kun Roger oli kahdeksanvuotias. Siellä isäni työskenteli tyhjiöputkien ja petrokemian parissa Radio Corporation of Americalle ja Esso Research and Engineeringille.

Lapsena Tsien kärsi astmasta ja vietti siksi paljon aikaa sisätiloissa. Hän osoitti epätavallisen korkeat kyvyt tieteelliseen tietoon, joka sitten kehittyi rakkaudeksi teoreettiseen ja käytännölliseen kemiaan. Tämä, ennustettavasti, alkoi kiinnostuksesta ligandivälitteistä kromoforien käyttäytymistä  kohtaan – metalli-ionien värillisistä siirtymistä, jotka ovat mukana monissa klassisissa epäorgaanisen kemian kokeissa – ja ilmeni selvimmin yrityksissä syntetisoida asetyylisalisyylihappoa , usein takapihalla. kodin astioissa ja improvisoiduilla soittimilla. Roger sai ensimmäisen partiopoikamerkkinsä palvelustaan ​​kemian alalla. Hänen muistikirjaansa, johon hän kirjoitti kahdeksanvuotiaana lapsena tekemänsä kemialliset kokeensa, säilytetään nyt Tukholman Nobel-museossa [7] .

Kouluvuodet

Taito kemiaan ja rakkaus sitä kohtaan säilyi nuorella Rogerilla hänen kouluvuosinaan. Hän suoritti kesätutkimusohjelman Ohion yliopistossa vuonna 1967 National Science Foundationin tuella. Tutkimuksessa keskityttiin tiosyanaatin (SCN - ) ympäristöominaisuuksiin, jotka johtuvat samanlaisesta negatiivisesta varausjakaumasta nukleofiilisten rikki- ja typpiatomien välillä. Tämä symmetrinen varausjakauma ehdotti mahdollisuutta muodostaa sidos, joka yhdistää kaksi tai useampia metalli-ioneja N- ja S-atomin sitoutumisen kautta luokan A ja B metalleihin, vastaavasti. Huolimatta siitä, että tämä työ ei tuottanut Rogerille iloa ja jopa ärsytti häntä, tutkimus sai kuitenkin korkeimman palkinnon vuonna 1968 osana Westinghouse Science Talent Search -kilpailua, kun hän oli 16-vuotias [7] .

Tutkijan urakehitys

Roger menee sitten Harvardiin , missä hänen kiinnostuksensa kemiaan keskeytti yliopiston taiteet. Yliopistossa Tsien tapasi Walter Gilbertin molekyylibiologian kursseilla, Jack Nicholsin, David Hubelin (Lontoon kuninkaallisen seuran ulkomainen jäsen, 1982) ja Torsten Wieselin (London kuninkaallisen seuran ulkomaalainen jäsen, 1982) neurofysiologian kursseilla. näköjärjestelmien ja Nelson Kiang kanssa kuulojärjestelmien neurofysiologiaa käsittelevillä luennoilla . Roger liittyi Phi Beta Kappaan kemiassa ja fysiikassa vuonna 1972 ja valmistui summa cum laude (cum laude) Harvardista Detur-palkinnolla. Edellä mainittujen opettajien neuvot saivat Rogerin onnistuneesti pätevöitymään Marshall-stipendiin, joka kattaa PhD-ohjelman Churchill Collegessa, Cambridgen yliopistossa , fysiologian laboratoriossa.

Cambridgen tohtoriprojektinsa johtaja, professori Richard Adrian oli kiinnostunut luurankolihasten aktivaation solufysiologiasta ; hän ja Tsien ystävystyivät. Adriania kiinnostaa enemmän se, että korkean henkisen ja tieteellisen tason opiskelijoille annetaan mahdollisuus kehittää alkuperäisiä pyrkimyksiään ja itsenäisyyttään kuin rekrytoida ahkerasti ja kiistämättä päätutkijan johdolla työskenteleviä alaisia. Näin oli yleensä Hillin vuonna 1965 perustamassa fysiologisessa laboratoriossa.

Tieteellisessä lähestymistavassa Tsien peri Adrianin sitoutumisen laboratoriotyöhön ja läheiset suhteet muutamiin kollegoihin, joilla oli poikkeuksellisia ominaisuuksia pienessä tutkimusryhmässä. Ohjaaja ja opiskelija tukivat toisiaan: vuosia valmistumisen jälkeen Roger piti yhteyttä mentoriinsa tämän elämän loppuun asti.

Työssä käytetyt sähköfysiologiset menetelmät (menetelmät solunulkoisen vasteen piirteiden tallentamiseksi yksittäisissä hermosoluissa suuressa keskushermostopopulaatiossa) eivät kiinnostaneet opiskelijaa jo pelkästään niiden vasteiden vuoksi yksinkertaisiin aistiärsykkeisiin. Hän kävi pitkiä keskusteluja Richard Adrianin kanssa Laplace-muunnoksen ja dendriittien kaapeliteorian soveltamisesta sähkövirran analysointiin viritteisiin kykenevissä soluissa; ensimmäinen loi myöhemmin perustan tehollisen kapasitanssin määritelmille hajautetussa kalvoverkossa [8] , ja keskustelu kaapeliteoriasta synnytti uusia "jännitepuristin"-menetelmiä, joita sovellettiin päättömiin kaapeleihin [9] .

Roger Tsien oli läheisessä yhteydessä kemisteihin, kuten Gerry Smithiin, Ian Baxteriin ja Jeremy Sandersiin University Chemistry Laboratoriesissa, sekä Arye Lew'n ja John Kimuran kanssa kollegoiden kanssa Denis Haydonin ryhmästä Physiological Laboratoriossa. Vaikka Tsien ei ollutkaan luonteeltaan ekstrovertti , hän solmi monia ystävyyssuhteita ja ammatillisia kontakteja yliopistossa [7] .

Viimeiset vuodet ja kuolema

Vuonna 2014 Tsien sai aivohalvauksen . Hän muutti vaimonsa Wendy Globen kanssa San Diegosta Eugeneen, Oregoniin. Kaksi vuotta myöhemmin, vuonna 2016, Tsien kuoli 64-vuotiaana ajaessaan polkupyörää.

Roger Tsienin tieteellinen perintö

Tsienin työ keskittyi erilaisten solufysiologian avainionien ja molekyylien mittausmenetelmien kehittämiseen. Nämä menetelmät puolestaan ​​johtivat työkalujen luomiseen, jotka mahdollistivat fysiologian tärkeiden ilmiöiden tekemisen ja niiden mekanismien purkamisen jo tiedemiehen elinaikana. Hän jätti jälkeensä myös joukon valmistuneita ja tutkijoita [7] .

Tsien tutki laajaa valikoimaa pieniä fluoresoivia molekyylejä ja fluoresoivia proteiineja, mikä johti tärkeiden menetelmien kehittämiseen erilaisten keskeisten biokemiallisten prosessien suoraa visualisointia varten elävässä solussa ja jopa elävissä organismeissa. Nämä aineet voidaan viedä soluun joko niiden tunkeutuvilla analogeilla tai ekspressoimalla niitä suoraan solussa käyttämällä molekyylibiologisia tekniikoita. Joitakin niistä voidaan käyttää yksittäisinä fluoresoivina komponentteina, toisia voidaan käyttää vuorovaikutteisina pareina ( FRET ). Tämä mahdollisti niiden käytön tutkimaan koko luokkaa solun fysiologisia prosesseja aina kysymyksestä siitä, ovatko tähän prosessiin osallistuvat geenit päällä, siirtymisestä osallistuvien proteiinien ilmentymisen, translokaation ja vuorovaikutuksen tutkimukseen ja lopettamiseen. tutkimalla itse fysiologisia prosesseja, jotka syntyvät proteiinien vuorovaikutuksessa [7] .

Tieteellinen tutkimus

Jatko-opiskelu ja jatkotutkimus Cambridgessa: biofysikaaliset menetelmät solun fysiologisen toiminnan seurantaan

Tsienin vuonna 1977 valmistuneelle väitöskirjalle "Kemiallisten instrumenttien suunnittelu ja käyttö solufysiologiassa" myönnettiin Cambridgessa arvostettu Gage-palkinto biologiassa sekä pääsy Comyns Berkeley Research Fellowship -ohjelmaan Gonvillessä ja Caius Collegessa. . Tänä aikana Tsien aloitti kemiallisten ja sitten molekyylibiologisten indikaattoreiden kehittämisen, jotka voidaan viedä soluun tai ekspressoida siinä tutkiakseen sen fysiologisia prosesseja. Tämä tehtävä rajoittui alun perin solunsisäisen kalsiumin pitoisuuden mittaamiseen, vaikka myöhempi työ sisälsi paljon laajemman valikoiman ioneja ja molekyylejä. Tsienin kiinnostus kalsiumin mittaamiseen tuli juuri oikeaan aikaan: 1970-luvun lopulla tiedeyhteisö alkoi vähitellen tunnustaa kalsiumin roolin sytosolissa keskeisenä toisena sanansaattajana. Sen liipaisuaktivaatio- tai säätelyvaihetta edeltävän modifikaation selvittäminen ja tämän prosessin hallinta vapaan ja sitoutuneen sytosoliosaston, solunsisäisten kalsiumvarastojen ja solunulkoisen tilan välisen vaihdon kautta on ollut keskeistä solun aktiivisuuden säätelymekanismin ymmärtämisessä.

Sähkökemiallisen menetelmän kehittäminen kalsiumionien havaitsemiseen ja kvantifiointiin

Tämä tieteellinen ongelma syntyi suorista mittauksista, jotka tehtiin elektrodeilla, jotka pystyivät tunkeutumaan virittymään kykenevän solun sisäpuolelle; tällaisia ​​mittauksia käytettiin alun perin määrittämään kalvopotentiaalit [10] . Natrium-, kalium-, vety- ja kloridi-ioneille selektiivisiä elektrodeja oli jo tuolloin saatavilla ja niitä käytettiin laajasti [11] , mutta kalsiumselektiivisten elektrodien käyttöä rajoittivat monet vaikeudet. Elektrodeille asetettiin vaatimus korkeasta selektiivisyydestä kalsiumionien suhteen muiden järjestelmässä mahdollisesti olevien kationien taustalla , mukaan lukien magnesium-, natrium- ja vetykationit, sekä korkea järjestelmän stabiilisuus ja minimaalinen hystereesi , kun kalsium keskittymismuutoksia. Tsien kehitti enemmän Ca 2+ -selektiivisiä, neutraaleja (toisin kuin käytetyt anionit - orgaaniset fosfaatit) ligandeja antureiksi [12] . Lisäksi tarvittiin elektrodeja, joiden kärjen halkaisija on riittävän pieni (noin 0,4 mikronia) [13] , jotta vältytään soluvaurioilta, jotka voisivat johtaa artefakttiin – paikallisen kalsiumpitoisuuden kasvuun. Kuitenkin tähän vaadittavat suuret resistanssit, jotka liittyvät elektrodiin, luokkaa 20-30 ja 60-120 GΩ liuoksessa, jonka p(Ca 2+ ) = 3, ja vaaditaan käytettäessä kärkeä, jonka halkaisija on 1,5 tai 0,5 μm puolestaan ​​johti mukautettujen, mittatilaustyönä valmistettujen elektrometrien luomiseen, joilla on erittäin korkea tuloimpedanssi ja alhaiset vakaat bias-virrat (alle 10 fA) väärien signaalien välttämiseksi.

Optimoiduilla elektrodeilla saadut kokeelliset tiedot täyttivät teoreettisesti odotetun Nernst-suhteen lähtöjännitteen miinus samanaikaisesti tallennetut kalvopotentiaalit ja vapaan kalsiumin pitoisuuden välillä 1 µM asti 0,1 M kaliumkloridissa, vasteen kestäen jopa 100 nM [Ca 2+ ] (kuva 1). Nämä mittaukset olivat yhdenmukaisia ​​jo vakiintuneella luminesenssispektroskopialla saatujen tietojen kanssa naarmujen jättiläismäisistä lihaskuiduista [14] ja sammakon luurankolihaksista [15] . Jälkimmäisessä mittaukset tehtiin käyttämällä aequorin fluoroforia , joka sisältää kolme Ca 2+ -sitovaa EF-käsimotiivia. Aequorin saatiin meduusasta Aequorea victoria , joka löydettiin Tyynestä valtamerestä Pohjois-Amerikan länsirannikolta; aine lähettää fluoresoivan välähdyksen virittyessään [16] [17] .

Optiset menetelmät Ca 2+ :n mittaamiseen käyttämällä kehitettyjä orgaanisia molekyylejä

Siten elektrodimenetelmät avasivat tien kalsiumin kvantitatiiviselle määritykselle laajoilla pitoisuusalueilla, olivat selektiivisiä kalsiumin suhteen magnesium- ja vetyionien taustalla ja soveltuivat sähköfysiologisiin tutkimuksiin. Kalsiumionien fysiologisen roolin selvittämiseksi solussa tarvittiin kuitenkin menetelmä, jota voidaan käyttää myös monenlaisissa koeolosuhteissa ja solutyypeissä. Tältä osin käytettävissä olevien fluoresenssitekniikoiden joukossa on ehdotettu useita optisia lähestymistapoja. Optiset menetelmät osoittavat paremman signaalin stabiilisuuden natriumioneille ja nopeamman vasteen verrattuna elektrodimenetelmiin, joten ne sopivat solutapahtumien seurantaan. Toisin kuin tietyssä pisteessä tehdyt mittaukset, optiset menetelmät mahdollistivat myös kalsiumpitoisuuden arvioinnin keskiarvona miltä tahansa kiinnostavalta alueelta ja karakterisoida kalsiumionien tilajakauma käytettävissä olevalla konfokaalimikroskopialla.

Tsienin tutkimus yhteistyössä Timothy Rinkin ja Tulio Pozzanin kanssa auttoi suuresti optisten mittausmenetelmien kehittämisessä ja teki niistä pääasiallisen lähestymistavan, jota käytetään nykyään kalsiumin solufysiologian tutkimuksessa. Oli välttämätöntä, että tähän tarkoitukseen kehitetyt ligandit pystyvät havaitsemaan muutoksia emissio- ja absorptioominaisuuksissa viritysolosuhteissa, jotka ovat yhteensopivia signaalin tallennusolosuhteiden ja solujen elinolosuhteiden kanssa. Lisäksi molekyylien tulee olla spesifisiä kalsiumille ja tarjota kyky mitata sekä stationäärisiä että keskimääräisiä ionin pitoisuuksia. Aekvoriinin luminesenssisignaali antoi toistettavat vasteet epätasapainoisiin pitoisuuksiin, mutta ligandilla oli kuitenkin alhainen affiniteetti ioniin, ja pitoisuuden ja signaalin välinen suhde ilmaistiin yhtälöllä, jonka potenssi on 2,5, mikä vaikeutti suuresti kokeen kvantitatiivista tulkintaa. , varsinkin kun tutkitaan heterogeenisiä ionejakaumia myoplasmassa [15] . Myöhemmin saataville tulleet fluoroforit antoivat suuremman affiniteetin, laajemman lineaarisuuden ja nopeamman assosioitumisen ionien kanssa (antipyrylatso-III, << 1 ms; dikloorifosfonaasi-III, <2 ms; arsenatso-III, 2-3 ms) - tämä teki siitä mahdollista seurata nopeita kalsiumin nousuja luustolihaksissa [18] . Kuitenkin aineet, kuten arsenatso-III ja anti-pyrylatso-III, osoittivat vaihtelevaa kalsiumin sitomisstoikiometriaa, jotka muodostivat 1:2- ja 2:1-komplekseja väriainepitoisuudesta riippuen; ne kokivat myös suuria muutoksia adsorptioominaisuuksissaan vasteena magnesium- ja vetyioneille kalsiumin läsnä ollessa [19] . Lisäksi indikaattorin merkittävien pitoisuuksien läsnäolo voi sinänsä vaikuttaa tutkittavaan järjestelmään: esimerkiksi antipyrilaasi III ja arsenatso III osoittivat erilaisia ​​​​absorptioaikariippuvuuksia suurten pitkien noin -20 mV jännitepulssien jälkeen. Tämä antaa aihetta uskoa, että toinen tai molemmat indikaattorit vaikuttivat kalsiumin siirtymiin [20] . Aine voi myös mahdollisesti sitoutua sytoplasmisiin komponentteihin tai erottaa ne ei-sytosolisiin osastoihin - nämä ovat mahdollisia tulkintoja, jotka perustuvat in vitro -kyvettikalibrointeihin. Lopuksi kaikki nämä indikaattorit vaativat viemistä soluun, mikä muistutti mikroelektrodimittauksia. Tämä rajoittaisi menetelmän soveltamisen vain riittävän vahvoihin, hyvin kiinnittyviin yksittäisiin suuriin soluihin, kuten lihassyytteisiin, kalmarin jättiläisaksoneihin ja Limulus -verkkokalvosoluihin .

Kyky tarjota spesifinen sitoutuminen kalsiumiin viimeksi mainitun fysiologisella pitoisuusalueella syntyi ajatuksesta muodostaa kelaattikompleksi neljän karboksyyliryhmän kanssa hyvin tunnetussa ligandissa etyleeniglykoli-bis(beeta-aminoetyylieetteri) -N,N. ,N`,N' -tetraetikkahappo (EGTA) (kuva 2a), joka muodostaa stoikiometrisen kompleksin ionin kanssa, jonka koostumus on 1:1 [21] . Tämä johti korkean affiniteetin puskurien ja optisten kalsiumindikaattoreiden järkevään suunnitteluun; ensimmäinen askel kehityksessä oli happea ja typpeä sitovien metyleeniryhmien korvaaminen fenyylitähteillä. Yhdessä näistä analogeista, 1,2-bis(2-aminofenoksi)etaani- N,N,N ' ,N' -tetraetikkahapossa (BAPTA), kaksi bentseenirengasta korvaa N- ja O-atomeja yhdistävät metyleeniryhmät säilyttäen molekyylin yleinen geometria, spesifisyys ja affiniteetti kalsiumin suhteen (kuvio 2b). BAPTA on laajalti käytetty ja tehokas solunsisäinen kalsiumpuskuri, jonka sitoutumiseen EGTA:han verrattuna väliaineen happamuus vaikuttaa vähemmän, se on selektiivisempi magnesiumväliaineen kalsiumin suhteen ja jonka muodostumis- ja tuhoutumisnopeus on suurempi. kompleksi.

EGTA kuitenkin absorboi valoa kauko-UV-alueella eikä fluoresoi. BAPTA:lle on ominaista UV-fluoresenssispektri, joka muuttuu kalsiumin sitoutuessa ja saavuttaa huippunsa noin 250 nm:ssä, mikä ei ole hyvä fluoresenssianalyysiin. Havaittiin, että yhden oksobentseenin korvaaminen metoksikinoliinirenkaalla johti absorptio- ja emissiomaksimien ilmaantumiseen aallonpituudella 340 ja 492 nm, vastaavasti, uudessa quin-2-yhdisteessä (kuvio 2c). Nämä aallonpituudet eivät kuitenkaan muuttuneet, mutta fluoresenssin intensiteetti kasvoi kuusinkertaiseksi kalsiumin sitoutuessa. Mittaukset kalibroitiin tyypillisillä lepotilan sytosolisilla kalsiumpitoisuuksilla (10 -7 M) ja sen alapuolella 10 -8 M asti. Muilla tuolloin käytettävissä olevilla menetelmillä oli optimaalinen havaitseminen vain aktivoiduilla pitoisuuksilla (10 -6 M), miten sitten levossa olevat signaalit olivat jo alle tunnistusrajan.

Lopuksi solujen inkubointi liuoksissa, jotka sisälsivät kalvoa läpäisevän asetometoksieetteriosan (AM) sitoutuneena quin-2:een (quin-2-AM), johti aineen atraumaattiseen, pysyvään sisäänpääsyyn soluun ilman mikromanipulaatiota tai kalvon rikkoutumista. Sen jälkeen, kun molekyyli tuli soluun, endogeeniset esteraasit leikkaavat pois esterikomponentin ja vapauttivat aktiivisen tetraanionin (7), joka ei kulkenut kalvon läpi (kuvio 2d). Fluoresenssin intensiteetin kasvua kalsiumpitoisuuden kasvaessa voitiin seurata käyttämällä tavanomaista kyvettispektrofotometriä. Siten quin-2 on saavuttanut avainaseman sytosolisen kalsiumin mittaamisessa useissa nisäkässoluissa ja niiden suspensioissa, mukaan lukien lymfosyyteissä, verihiutaleissa, siittiöissä, neutrofiileissä ja makrofageissa, erityisesti tutkittaessa kalsiumin roolia signaali-vasteprosessissa. [22] [23 ] . Jatkossa tätä esteröityjen, kalvoa läpäisevien johdannaisten viemismenetelmää soluun laajennettiin tutkimaan ehdokasmolekyylien, kuten fosfatidyyli-inositoli-3,4,5-trifosfaatin, roolia solujen lähettiläissä solufysiologiassa [24] . ] .

UC Berkeley: Uudet ligandit solunsisäisen kalsiumin ja muiden ionien mittaamiseen ja manipulointiin

Mahdollisesti Isossa-Britanniassa tieteidenvälistä tutkimusta tekevien tutkijoiden työllistymisvaikeuksien ja epäselvien työnäkymien vuoksi, vuonna 1981 Tsien hyväksyi niin merkittävän tutkimuksen jälkeen kutsun saada työpaikka yliopiston fysiologian ja anatomian laitokselle . Kalifornian Berkeleyssä (tuohon aikaan laitosta johti Terry Manchen) apulaisprofessorin nopeudella. Tsien työskenteli siellä kahdeksan vuotta, yksi työalueista oli kalsiumherkkien ligandien jatkokehitys ja optimointi yhteistyössä Steven Adamin ja Robert Zuckerin kanssa. Tämän projektin ansiosta kaupalliseen tuotantoon otettiin monia solufysiologiassa erittäin laajalle levinneitä reagensseja. Kaikki ne saapuivat soluihin sen jälkeen, kun tutkittua järjestelmää oli inkuboitu vastaavien AM-johdannaisten kanssa. Aineet, jotka yhdistävät 8-koordinaattisen tetrakarboksylaattikelatoivan osan stilbeenikromoforin kanssa, paransivat kalsiumselektiivisyyttä muihin kaksinkertaisesti varautuneisiin kationeihin verrattuna ja vain hieman alhaisemman affiniteetin kuin quin-2 [21] . Näiden aineiden affiniteetit vaihtelivat välillä K d = 100 nM (quin-2) K d = 90 μM (fluori-5N), mikä kattoi tyypilliset fysiologiset kalsiumpitoisuudet useissa kiihtyneissä ja lepäävissä solutyypeissä. Suuremmat viritysaallonpituudet verrattuna quin-2:een (339 nm) mahdollistivat solujen ultraviolettisäteilyn välttämisen, mikä voisi johtaa virittyneen solun autofluoresenssiin ja aiheuttaa sen vaurioita. Stilbeenin eteeniryhmän lisääminen heterosykliseen renkaaseen paransi kvanttisaantoa ja fotokemiallista stabiilisuutta - fluoresenssin intensiteetti saattoi kasvaa jopa 30-kertaiseksi. Tämä ekstinktiokertoimen ja kvanttisannon parannus verrattuna quin-2:een (<5000 ja 0,03 verrattuna 0,14:ään, vastaavasti) vähensi myös järjestelmässä tarvittavan leimauksen määrää (siis quin-2:n tapauksessa puhumme millimolaarista pitoisuudet). Tosiasia on, että suuret määrät voivat mahdollisesti muodostaa puskurijärjestelmän solunsisäisen kalsiumin kanssa ja häiritä tutkittavaa prosessia.

Lopuksi aineiden fluoresenssin intensiteetin muuttamisen lisäksi myös kalsiumin sitoutumisen aallonpituudet muuttuivat, kun taas quin-2 aiheutti muutoksia vain signaalin voimakkuudessa (tämä teki mittauksesta herkän säteilyn intensiteetin, signaalin havaitsemisen, ligandipitoisuuden vaihteluille, ja tehollinen solupaksuus optisessa säteessä). Mittaukset, joissa käytettiin spektrisiirtoja absorptio- ja/tai emissioalueella, mahdollistivat näiden artefaktien lähteiden ohituksen [25] . Siten indo-1:llä oli kaksinkertainen emissiohuippu pääsiirtymällä 475:stä 400 nm:iin kalsiumin sitoutuessa. Indo-1 on löytänyt laajan sovelluksen virtaussytometriassa (kuvio 3a). Fura-2 emittoi vain yhdellä aallonpituudella 510 nm, mutta virityshuippu siirtyy noin 380 nm:stä 350 nm:iin sitoutuessaan, ja intensiteettisuhde on suoraan verrannollinen ionipitoisuuteen. Tämän yhdisteen korkea fotonisaanto teki siitä kätevän käyttää jopa reaaliaikaista videotallennusta solunsisäisen kalsiumin paikallisesta pitoisuudesta [26] (kuva 3b).

Nämä saavutukset johtivat fysiologisiin prosesseihin osallistuvien ionien ja molekyylien laajan luokan uusien ilmaisinmolekyyleiden luomiseen [27] . Ensinnäkin nämä uudet variantit mahdollistivat kalsiumin pitoisuuden mittaamisen eri olosuhteissa ja solutyypeissä. Fluo-3-signaali tallennetaan näkyvälle alueelle viritettäessä argonlaserilla aallonpituudella 488 nm, ja kasvaa sitoutuessa emissiomaksimiin 525 nm:ssä, mikä on lähellä fluoreseiini-isotiosyanaatilla (FITC) tehdyissä mittauksissa havaittuja arvoja ( kuva 3c). Sen nopeampi dissosiaatio fura-2:een verrattuna mahdollistaa kalsiumin nopean kinetiikan seuraamisen luusto- ja sydänlihaksissa. Tämä on ollut erityisen hyödyllistä tallennettaessa mikroskooppisia kalsiumin vapautumistapahtumia ("kalsiumin välähdyksiä") konfokaalimikroskopiaa käyttäen.28 Ominaisuutta on käytetty myös tuloksena olevien piilotettujen Ca 2+ -aaltojen tallentamiseen , mikä heijastaa lisääntynyttä kalsiumin vapautumista sarkoplasmisen retikulumin ryanodiinireseptoreista. , joka johtuu kanavien konjugoinnin puutteesta transmembraanisen dihydropyridiinireseptorin kanssa luustossa [29] tai proarytmisissä olosuhteissa sydänlihaksissa [30] [31] .

Toiseksi, tuli mahdolliseksi havaita ja mitata pitoisuus ei vain solunsisäiselle kalsiumille, vaan myös muille prosesseihin osallistuville. Esimerkiksi karboksifluoreseiinijohdannaisen 2',7'-bis-(2-karboksietyyli)-5-(u-6)-karboksifluoreseiinin (BCECF) karboksyyliryhmät sopivat vetyionien määrittämiseen paremmin kuin kalsium. BCECF:n saavutettavuus saavutettiin soluun läpäisevällä AM-analogilla, ja itse aineella oli yksi emissiohuippu (535 nm) ja kaksinkertainen virityshuippu (noin 490 ja 440 nm). Sen pKa ( noin 6,98) ja lineaarinen vaste pH-arvojen 6,4 ja 7,4 välillä varmistivat sen käyttökelpoisuuden mahalaukun parietaalisolujen solufysiologiassa [32] .

Kolmanneksi valo saattoi vapauttaa palautuvasti kalsiumia Nitr-2:sta ja kehitti myöhemmin Nitr-5:n ja DM-nitrofeenin [33] . Nitr-2 koostuu kalsiumia kelatoivasta BAPTA:sta, joka on kytketty nitropiperonyyliryhmään, joka pystyy fotolyysiin lähellä ultraviolettivaloa (300–400 nm). Tämä tapahtuma muuttaa merkittävästi kalsiumin dissosiaatiovakion arvoista 160 ja 630 nM arvoon 7 ja 18 µM ionivakioilla 0,1 ja 0,3 M, vastaavasti, vapauttaen sitoutunutta kalsiumia ja muuttaen siten solunsisäisen kalsiumin pitoisuutta [34] (kuvat 4a-c). ). Ominaisuus on löytänyt sovelluksen hermosolujen ionivirtojen fotokemiallisessa säätelyssä [35] . Sitten Tsien kehitti tämän lähestymistavan muihin bioaktiivisiin ohjaimiin, ja spatiaalinen resoluutio saavutettiin fokusoimalla laserherätyslähde kolmeen koordinaattiin. Tämän seurauksena bromattujen 7-hydroksikumarin-4-yylimetyylien kytkeminen ehdokasvälittäjiin paransi vapautumissaantoa käyttämällä kahden fotonin infrapunaviritystä (toisin kuin UV-viritystä) ja mahdollisti ensimmäistä kertaa kolmiulotteisen kartan saamisen. glutamaattiherkkyydestä rotan aivokuoren neuronien osissa [36] .

Fluoresoivien proteiinimarkkerien kehittäminen

Jo ennen kuin Tsien muutti San Diegoon vuonna 1989, Alexander Glaserin työ fluoresoivista fykobiliproteiineista herätti hänen kiinnostuksensa fluoresoivaan cAMP-seurantaan. Hän piti luonnollisia cAMP:tä sitovia proteiineja fluoresoivan leiman perustana: tämä voisi tarjota välittömästi vaaditut affiniteetit ja selektiivisyydet. CAMP:n puuttuessa fosfokinaasi A (PKA) on inaktiivinen ja sen säätely- ja katalyyttiset alayksiköt ovat tiukasti kytkettyinä (kuvio 5). cAMP:n sitoutuminen säätelyalayksiköihin johtaa dissosiaatioon ja katalyyttiseen aktivaatioon, mikä mahdollistaa fosfaatin siirtymisen ATP:stä tiettyihin spesifisiin proteiineihin. Optisen signaalin antaminen entsyymille tällaisia ​​sitoutumistapahtumia varten toi Rogerin takaisin yliopiston kiinnostukseen fluoresoivan resonanssienergian siirrosta (FRET) kahden valoherkän kromoforin välillä, jotka ovat steerisesti lähellä toisiaan. Kiihtynyt luovuttajakromofori voi siirtää energiaa vastaanottajalle ei-säteilyllisen dipoli-dipoli-vuorovaikutuksen vuoksi. Tämä järjestelmä rakennettiin liittämällä tyypin 1 fluorofori säätelyalayksikköön ja tyypin 2 fluorofori katalyyttiseen alayksikköön. FRET voisi syntyä ehjässä PKA:ssa kahden tyypin alayksiköiden läheisessä kosketuksessa, mutta sen olisi pitänyt kadota dissosioituessa cAMP-sitoutumisen jälkeen: silloin signaalit näissä kahdessa tilanteessa havaittaisiin eri aallonpituuksilla. Näille Suzanne Taylorin ryhmän kanssa suoritetuille kokeille oli tunnusomaista kova työ, joka vaati suurta sinnikkyyttä: tarvittiin suuria määriä rekombinantti-PKA-alayksiköitä. Vaikeuksista huolimatta projekti onnistui ja synnytti menetelmän, jossa fluoreseiinileimatut katalyyttiset alayksiköt sitoutuvat rodamiinileimattuihin säätelyalayksiköihin muodostaen cAMP FRET -antureita [37] . Tätä menetelmää on käytetty osteoblastien [38] , melanosyyttien [39] ja Aplysia- neuronien [40] tutkimuksessa .

Kalifornian yliopistossa San Diegossa: geneettisesti koodattujen makromolekyyli-indikaattoreiden kehittäminen

Fluoresoivien proteiinien käyttö täydensi siten tyylikkäästi pienmolekyylipainoisten ligandien luokkaa. Tarvittavia proteiineja oli kuitenkin ilmennettävä ja puhdistettava valtavia määriä kahden eri leiman liittämiseksi selektiivisesti eri proteiinidomeeneihin tai alayksiköihin in vitro samalla kun proteiinien toiminnot säilytettiin. Lisäksi aiemmissa töissä proteiineja jouduttiin viemään soluun. Nämä vaikeudet pakottivat tutkijat kehittämään suoraan genomiin koodattuja indikaattoreita - tässä tapauksessa oli tarpeen viedä tutkittaviin soluihin vain geenejä, jotka koodaavat kahta oikeanväristä fluoresoivaa proteiinia. Tällä lähestymistavalla oli paljon pienemmät vaatimukset ja se sisälsi vakiintuneiden menetelmien käytön solujen transfektoimiseksi pienellä määrällä DNA:ta (verrattuna proteiinin lisäämiseen) ja myöhemmän selektiivisen transfektoitujen solujen valinnan. Tämä tehtävä kiinnitti Tsienin huomion meduusaan Aequorea victoriaan (toisen kerran) , joka on klassisissa fysiologisissa kokeissa niin hyödyllinen akvoriinin [16] lähde . Shimomura löysi, eristi ja puhdisti vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) noin 10 000 yksilöstä, minkä jälkeen sen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, mukaan lukien spektri, karakterisoitiin erilaisissa olosuhteissa. Hän osoitti, että GFP on FRET-viritysakseptori ekvoriinin luovuttajasta ja tuottaa in vivo -fluoresenssia spektrin vihreällä alueella, joka eroaa puhdistetun ekvoriinivalmisteen sinisestä signaalista virittyessä UV-alueella [41] . Shimomura tunnisti myös kromoforin p -hydroksibentsylideenimidatsoliiniosan proteiiniketjusta [42] .

Douglas Prasherin [43] GFP-geenin osan karakterisointi aloitti yhteistyön eri laboratorioissa. Roger on työskennellyt GFP:n tuotanto- ja fluoresenssiominaisuuksien parissa käyttämällä Saccharomyces cerevisiaea yhteistyössä Roger Heimin ja Scott Emren kanssa. Martin Chalfie (Lontoon kuninkaallisen seuran ulkomaalainen jäsen, 2018) Columbian osavaltiosta, joka ensin osoitti selkärangattomien soluihin ruiskutetun GFP:n UV-indusoidun fluoresenssin ja ehdotti proteiinin mahdollista käyttöä biomarkkerina, on työskennellyt sen ilmentyminen Escherichia colissa ja Caenorhabditis eleganissa. Tsienin tutkimus johti Y66H-mutantin (BFP) löytämiseen, jolla on parannettu stabiili sininen fluoresenssi verrattuna alkuperäiseen villityypin GFP:hen. Proteiinin lisämodifikaatiot, jotka sopivat stereokemiallisesti tryptofaaniin, johtivat syaanifluoresoivaa proteiinia (CFP) koodaavan Y66W-mutantin ilmestymiseen [44] [45] (kuvio 6a). FRET-parissa konformaatiomuutokset UV-virittyneen BFP:n rakenteessa johtivat energian siirtymiseen GFP:hen (kuvio 6b). Tämä merkitsi GFP:n kykyä innostua BFP:n luovuttajan lähettämistä sinisistä aallonpituuksista. Kuitenkin GFP-viritysspektrillä oli suuri huippu UV-alueella ja pieni piikki sinisellä alueella. Ongelma ratkaistiin luomalla mutantti GFP-variantti: ei-toivottu huippu UV-alueelta hävisi ja sininen kasvoi noin 5-6 kertaa myöhemmällä +10 nm:n siirrolla S65T-mutaation jälkeen [45] . Yrittäessään testata hypoteesia tutkijat ottivat käyttöön peptidisidoksen BFP:n ja GFP-S65T-mutantin sekä muiden mutanttien, joilla on samanlainen viritysprofiili kuin GFP-S65T:n, välille. BFP:n selektiivinen UV-viritys johti todellakin erilaisiin vihreän ja sinisen emissiotyyppeihin FRET-siirron läsnäollessa tai poissa ollessa ennen proteiinitrypsinolyysiä ja sen jälkeen. Lisätestaukset vahvistivat, että S65T on optimaalinen fluorofori, kun F64L-mutaatio otetaan käyttöön, mikä saa aikaan rakenteen säilymisen ja laskostumisen korkeammissa lämpötiloissa [46] . Tämä kaksoismutantti, josta käytetään nimitystä "parannettu (S65T-F64L) GFP", on kaupallisesti saatavilla Clontechilta.

GFP-S65T:n rakennetutkimukset paljastivat sylinterimäisen rakenteen, jonka halkaisija oli 2,4 nm ja pituus 4,0 nm, sisältäen 11 β-säikettä, jotka ympäröivät aksiaalisesti pitkänomaista heliksiä, jonka keskelle asetettiin kromofori [47] (kuva 7 ). ). Siten ryhmittely oli suojattu liuottimen ja vieraiden entsyymien vaikutuksilta, mutta ontelon sisällä oli tilaa mahdolliselle aromaattisen renkaan tuomiselle, joka liittyisi pinoamalla kromoforin kanssa; tämä varmistettiin myöhemmin lisäämällä useita mutaatioita, mukaan lukien T203Y, tämän variantin spektrin viritys- ja emissiosiirrot olivat noin 20 nm. Tuloksena saatu keltainen fluoresoiva proteiini (YFP) ja sen muut mutanttivariantit osoittautuivat hyviksi signaalin vastaanottajiksi CFP:stä ja muodostivat vaihtoehtoisia CFP/YFP-pareja.

Roger vahvisti myös kromoforin p - hydroksibentsylideenimidatsoliiniosan muodostumisen tähteistä S65, Y66 ja G67 GFP-ketjussa [31] . Kromoforin ilmaantumisen mekanismi sisälsi yllättävän de novo heterosyklin muodostumisen, jossa α-β C-C-sidos dehydrattiin kaksoissidoksen muodostamiseksi. Tätä varten tarvittiin vedyn vastaanottaja - Tsien uskoi, että se oli ilmakehän happea. GFP:tä tuottavien bakteerien viljely anaerobisissa olosuhteissa johti siihen, että syntetisoidulla proteiinilla ei ollut fluoresenssia, mutta se ilmeni useita tunteja sen jälkeen, kun proteiini oli altistettu ilmalle [44]  , ominaisuus, joka löysi myöhemmin käyttökelpoisuutensa fysiologia.

Detektoriproteiinien luominen yhdistämällä "FRET-donori" - "akseptori GFP-proteiini"

Spesifisten solunsisäisten signaalien FRET-kuvauksen käyttö edellytti FRET-komponenttien kytkemistä molekyyliin, joka sitoisi spesifisesti tutkittavan solukomponentin. Yhteistyössä Atsushi Miyawakin kanssa Roger yritti kiinnittää luovuttaja- ja vastaanottajaproteiinit äskettäin kloonatun inositoli-1,4,5-trifosfaatti (InsP3) -reseptorin sytosolisen domeenin vastakkaisiin päihin. Todennäköisimmin tämä työ heijasti hänen kiinnostuksensa solukalvojen väliseen kemialliseen signalointiin. Projekti johti ymmärrykseen siitä, kuinka tämä tärkeä lähettiläs toimii luurankolihaksessa viritys-supistumisliitoksessa [48] ja kuinka Ca 2+ -influx-tekijä [49] toimii , mikä mahdollistaa transduktion solunsisäisistä Ca 2+ -varastoista solun kalvon pinnalle. varastokäyttöinen Ca 2 + -portti [50] . Signaloinnin tapauksessa myöhemmin todistettiin, että prosessi etenee suoran, ei kemiallisen, pinnan L-tyypin kalsiumkanavien ja intrasellulaaristen sarkoplasmisten retikulaaristen ryanodiinikalsiumin vapautumisreseptorien välisen kytkennän vaikutuksesta [51] . InsP3:n reseptoreihin sitoutumisen mekanismin epätäydellisestä ymmärtämisestä johtuvat vaikeudet pakottivat Tsienin kuitenkin kiinnittämään huomionsa muiden solunsisäisten kalsiumilmaisimien kehittämiseen yhdessä Mitsushiko Ikuran kanssa. Tämä työ sisälsi BFP:n ja sitten CFP:n kiinnittämisen kalmoduliinin (CaM) N-päähän. S65T ja sitten YFP päinvastoin kiinnitettiin kohde-M13-peptidin C-päähän. Lopullinen rakenne saatiin yhdistämällä CaM- ja M13-fragmentteja [52] [53] .

Tällä tavalla saadut geneettisesti koodatut leimat ("kameleontit"), joita voidaan käyttää pitkällä aikavälillä ja joita voidaan soveltaa mihin tahansa soluun tai organismiin, johon tällaista DNA:ta voidaan viedä, johtivat yhden suosituimmista menetelmistä aktiivisuuden seurantaan tunnistetuissa. hermosoluja ja laajensi tutkittujen kohteiden valikoimaa koskemattomiin hermostojärjestelmiin. Lisäksi ne ovat työntäneet käytettyjen biologisesti tärkeiden molekyylien rajoja. Tutkijoiden merkittävät ponnistelut ovat johtaneet linkkereiden löytämiseen, jotka varmistavat fluoresoivien proteiinien fuusion PCA:n kanssa säilyttäen samalla alayksiköiden kyvyn reagoida cAMP:n läsnäoloon. Tällaiset proteiinit voisivat visualisoida cAMP:n subsellulaarisen jakautumisen kardiomyosyyteissä katekoliamiinistimulaation jälkeen [54] . Lopuksi modifioitu kameleontti, jossa M13 korvattiin kinaasisubstraattipeptidillä ja CaM proteiinidomeenilla, joka sisälsi fosfoaminohappoa sitovan domeenin, joka voi sitoa fosforyloitua seriiniä, treoniinia tai tyrosiinia, pystyi visualisoimaan seriiniä spesifisesti fosforyloivien kinaasien aktiivisuuden. treoniini tai tyrosiini. Näiden tähteiden fosforylaatio kinaasilla johtaa kompleksin muodostumiseen, jossa luovuttaja- ja vastaanottajaproteiinien välinen etäisyys tai orientaatio muuttuu [55] . Pian tästä menetelmästä tuli korvaamaton tutkimuskäytännössä.

Fluoresoivien proteiinien väripaletin täydentäminen; FRET-alueen laajentaminen kalvopotentiaalin mittaamiseen

Lisäkehitys on lisännyt fluoresoivien proteiinien arsenaalia, joka kattaa laajan spektrin ja mahdollistaa valokytkennän [56] [57] [58] . Korallipunaista fluoresoivaa proteiinia (DsRed) koodaavan geenin [59] löytäminen ja saatavuus sai Rogerin menemään tutkimuksessaan GFP:tä pidemmälle. DsRed on tetrameeri, jonka kromoforiosa alkaa samalla tavalla kuin GFP:ssä. Jatkuva dehydraus johtaa kuitenkin asyylimiinin muodostumiseen, joka on stabiili vain ehjän proteiinin ympäristössä ja osoittaa pitkän aallonpituuden muutosta absorptio- ja emissiospektreissä [60] [61] . Suunnatun evoluution avulla luotiin monomeerinen punainen fluoresoiva proteiini (RFP), joka on vähemmän vaativa fuusioimaan muiden proteiinien kanssa tetrameeriin verrattuna ja josta tuli perusta koko sarjalle monomeerisia proteiineja, joiden emissiomaksimit peittivät muun näkyvän spektrin. 648 nm asti [62] .

Roger osallistui myös itse FRET-tekniikan manipuloimiseen, ja hän jatkoi varhaisia ​​tutkimusintressejä kalvopotentiaalin optisissa mittauksissa. Tämä on pystynyt parantamaan vakiintuneita, mutta usein suhteellisen hitaita tai epäherkkiä menetelmiä, jotka perustuvat yhteen indikaattorifluoroforiin. Kaksikomponenttisessa, FRET-pohjaisessa lähestymistavassa käytettiin luovuttajana fluoresoivia lektiinejä ja myöhemmin kumariinileimattua fosfatidyylietanoliamiinia sitoutuneena kalvon ulkopuolelle (kuvio 8). Luovuttajat siirsivät energiaa varautuneeseen transmembraaniseen bis(1,3-diheksyyli-2-tiobarbituraatti)tri(tai penta)metinoksonoliakseptoriin, kun se siirtyi kalvon ulkopuolelta sisäpuolelle varauksen seurauksena kalvopotentiaalin muuttuessa. Tämä lähestymistapa mahdollisti ennennäkemättömän herkkyyden (joista 100 mV:ta kohden fluoresenssisignaali kasvoi yli 50 %) ja lyhyitä aikavakioita (alle 0,4 ms) muihin optisiin indikaattoreihin verrattuna [63] .

Solufysiologiasta systeemifysiologiaan, translaatiolääketieteeseen ja uusien indikaattoreiden levittämiseen

Tieteellisen uransa loppupuolella Tsien pystyi kehittämään sellaisia ​​optisia analyysityökaluja, joita käytettiin erityisen menestyksekkäästi kokonaisten elinten tai jopa eläinten tutkimuksessa. Näitä työkaluja voitaisiin mahdollisesti käyttää kliinisen, neurokirurgisen, sydän- ja verisuoni- tai onkologisen lääketieteen aloilla. Jotkut niistä on kehitetty yhteistyössä Nguyen Thao Quyenin ( vietnam: Quyến Thẩm Nguyễn ) kanssa . Uusi fluoresoivasti leimattu F-NP41-molekyyli, joka viedään helposti soluun ja sitoutuu hermoon ja jonka tarkoituksena on olla vuorovaikutuksessa tyvikalvoproteiinin laminiinin kanssa, voi parantaa kroonisesti typistyneiden hermojen toiminnallista visualisointia [64] [65] , mahdollisesti yksinkertaistaa "korjaus" hermojen suunnittelua ja kirurgista toteutusta [66] [67] . Positroniemissiotomografialeimaustekniikkaa, jossa käytetään injektoituja erytrosyyttejä, jotka on leimattu positroneja emittoivalla, multimodaalisella fluoresoivalla leimalla, voitaisiin mahdollisesti käyttää kallonsisäisen verenvuodon havaitsemiseen vaihtoehtona 99mTc-leimatuille aineille [68] , ja se voisi olla hyödyllinen aivojen patofysiologisten prosessien kokeellisissa NMR-tutkimuksissa. [69] . Sellaisten kalvoon läpäisevien peptidien käyttöönotto, jotka osoittavat merkittäviä muutoksia fluoresenssissa kasvaimeen liittyvien proteaasien leikkaamisen jälkeen solun sisällä, voisi mahdollisesti auttaa pahanlaatuisten leesioiden varhaisessa diagnosoinnissa [70] . On havaittu, että sekä nämä aktivoivat peptidit että niiden gadoliiniin sitoutuneet dendrimeeriset muodot kertyvät selektiivisesti kasvainsoluihin, mikä parantaa jälkimmäisen havaitsemista ja tarjoaa keinon niiden tulevaan NMR-diagnoosiin [71] . Aktivoivia peptidejä on samalla tavalla käytetty antitubuliinin radioherkistävän monometyyliauristatiini E:n selektiiviseen toimittamiseen kasvainsoluihin, mikä avaa näille aineille uuden terapeuttisen horisontin [72] .

Tsien on koko uransa ajan yrittänyt tuoda kehittämänsä ligandit kollegoiden saataville. Quin-2:n varhaisessa kehittämisessä Roger ei onnistunut vakuuttamaan Yhdistyneen kuningaskunnan kansallista tutkimus- ja kehitysyhtiötä kalsiumille herkän yleisen rakenteen kaupallisesta arvosta ennennäkemättömällä tarkkuudella ja selektiivisyydellä. Myöhemmin Lancaster Synthesis (nyt osa Johnson Matthey Company Alfa Aesaria) ilmaisi kiinnostuksensa quin-2:een ja sen AM-johdannaiseen. Yksi Rogerin tieteellisen toiminnan tuloksista on noin 160 Yhdysvaltain patenttia. Tsien perusti myös useita yrityksiä: Charles Zuckerin kanssa hän loi Aurora Biosciences Corporationin, joka tuottaa työkaluja lääkekehitykseen fluoresoivia markkereita käyttäen, ja Senomyxin, joka etsii makuhermomodulaattoreita. Hänen patenttiensa ansiosta myös muut ihmiset ovat voineet perustaa yrityksiä, kuten Molecular Probes.

Kunniamerkit ja palkinnot

Nobel-palkinto

Roger jakoi vuoden 2008 Nobelin kemian palkinnon Osamu Shimomuran ( Woods Hole Marine Biological Laboratory ) ja Martin Chalfien ( Columbia University , USA) kanssa. Komitean sanamuoto korosti erityisesti Tsienin panosta GFP:n ja siihen liittyvien proteiinien fluoresoivien ominaisuuksien ymmärtämiseen, mikä johti niiden soveltamiseen elävien järjestelmien dynaamisten prosessien tutkimuksessa. Kunnioituksena ja kunnioituksena Douglas Prasheria kohtaan, joka aloitti GFP:n opiskelun, hän kutsui Tsienin seremoniaan.

Muut palkinnot

Jäsenyys järjestöissä ja yhteisöissä

Perhe

Tsien oli naimisissa Wendy Globen kanssa. Rogerilla ei ollut omia lapsia; kasvatti poikapuolensa Max Rinkin vaimonsa kanssa.

Henkilökohtaiset ominaisuudet

Ystävänsä Christopher Huangin mukaan Tsienillä ja hänen valmistuneella ohjaajallaan Richard Adrianilla "jakoi samanlaiset tieteelliset ja henkilökohtaiset arvot, käyttäytyminen, ystävällinen, antelias, kunnioittava asenne maailmaa kohtaan sekä äärimmäisen rehellinen ja inhimillinen asenne muita kohtaan."

Kiinnostuksen kohteet ja harrastukset

Harrastaa amatöörivalokuvausta. Hän rakasti ulkoilua.

Katso myös

Muistiinpanot

  1. ↑ 1 2 3 4 https://www.washingtonpost.com/national/health-science/roger-y-tsien-chemist-shared-nobel-for-tool-to-research-alzheimers-dies-at-64/2016 /08/31/90ca6de8-6fc9-11e6-8533-6b0b0ded0253_story.html
  2. ↑ 1 2 Roger Y. Tsien // Encyclopædia  Britannica
  3. ↑ 1 2 Roger Y. Tsien // Brockhaus Encyclopedia  (saksa) / Hrsg.: Bibliographisches Institut & FA Brockhaus , Wissen Media Verlag
  4. ↑ 钱永健研水母发光盼助治癌(linkki ei saatavilla) . Lianhe Zaobao . Haettu 8. lokakuuta 2008. Arkistoitu alkuperäisestä 25. joulukuuta 2018. 
  5. ↑ Roger Y. Tsien Kalifornian yliopistosta, San Diegosta  (linkki ei saatavilla)  (linkkiä ei ole saatavilla)
  6. ↑ Nobel-palkintokomitean verkkosivusto . Haettu 8. lokakuuta 2008. Arkistoitu alkuperäisestä 26. lokakuuta 2012.
  7. ↑ 1 2 3 4 5 Huang CL-H. Roger Yonchien Tsien. 1. helmikuuta 1952 - 24. elokuuta 2016 // Biogr. Mems Fell. R. Soc., 2018, v. 65, s. 405-428.
  8. ↑ Adrian RH, Almers W. Membraanikapasiteetin mittaus luustolihaksessa.// Nat. New Biol., 1973, v. 242, s. 62-64.
  9. ↑ Adrian, RH, Marshall, MW Natriumvirtaukset nisäkkäiden lihaksissa // J. Physiol., 1977, v. 268, s. 223-250.
  10. ↑ Adrian RH Sisäisen ja ulkoisen kaliumpitoisuuden vaikutus sammakon lihaksen kalvopotentiaaliin. // J. Physiol., 1956, v. 133, s. 631-658.
  11. ↑ Thomas R. Ionille herkät solunsisäiset mikroelektrodit. New York, NY: Academic Press, 1978.
  12. ↑ Tsien RY, Rink TJ Neutraali kantaja-ioniselektiiviset mikroelektrodit solunsisäisen vapaan kalsiumin mittaamiseen. // Biochim. Biophys. Acta Biomembr., 1980, v. 599, s. 623-638.
  13. ↑ Tsien RY Nesteanturit ioniselektiivisille mikroelektrodeille. // Trends Neurosci., 1980, v. 3, s. 219-221.
  14. ↑ Tsien RY, Ashley C., Rink TJ Vapaan Ca:n muutokset lihasten supistumisen aikana, mitattuna intrasellulaarisella Ca-selektiivisellä elektrodilla // J. Physiol., 1978, v. 280, s. 27.
  15. ↑ 1 2 Blinks JR, Rüdel R., Taylor SR Kalsiumtransientit eristetyissä sammakkoeläinten luustolihaskuiduissa: detektio aequorinilla // J. Physiol., 1978, v. 277, s. 291-323.
  16. ↑ 1 2 Shimomura O., Johnson F., Saiga Y. Aequoriinin, bioluminesoivan proteiinin, uuttaminen, puhdistus ja ominaisuudet valovoimaisesta hydromedusaanista, Aequorea // J. Cell Comp. Physiol., 1962v. 59, s. 223-239.
  17. ↑ Shimomura O. Aekvoriinin luminesenssin laukaisee kahden kalsiumionin sitoutuminen // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, v. 211, s. 359-363.
  18. ↑ Csernoch L., Huang CL-H., Szucs G., Kovacs L. Tetrakaiinin differentiaaliset vaikutukset varausliikkeisiin ja Ca2+-signaaleihin sammakon luustolihaksessa // J. Gen. Physiol., 1988, v. 92, s. 601-612.
  19. ↑ Baylor SM Optiset tutkimukset viritys-supistumiskytkennästä käyttäen jännite- ja kalsiumherkkiä antureita // Comp. Physiol., 2011 (alkuperäinen julkaisu: Handb. Physiol., Skelet. Muscle Suppl., 1983, v. 27, s. 355-379).
  20. ↑ Palade P., Vergara J. Arsenatso-III ja antipyrylatso-III kalsiumtransientit yksittäisissä luustolihaskuiduissa // J. Gen. Physiol., 1982, v. 79, s. 679-707.
  21. ↑ 1 2 Tsien RY Uudet kalsiumindikaattorit ja puskurit, joilla on korkea selektiivisyys magnesiumia ja protoneja vastaan: prototyyppirakenteiden suunnittelu, synteesi ja ominaisuudet // Biochemistry, 1980, v. 19, s. 2396-2404.
  22. ↑ Tsien RY, Pozzan T., Rink TJ T-solumitogeenit aiheuttavat varhaisia ​​muutoksia sytoplasman vapaassa Ca2+:ssa ja kalvopotentiaalissa lymfosyyteissä. Luonto, 1982, v. 295, s. 68-71.
  23. ↑ Tsien RY, Pozzan T., Rink T. J. Kalsiumin homeostaasi koskemattomissa lymfosyyteissä: sytoplasminen vapaa kalsium, jota seurataan solunsisäisesti pidätetyllä fluoresoivalla indikaattorilla // J. Cell Biol., 1982, v. 94, s. 325-334.
  24. ↑ Tsien RY, Jiang T., Sweeney G., Rudolf MT, Klip A., Traynor-Kaplan A. Membranepermeant esterit fosfatidyyli-inositoli 3,4,5-trisphosphate // J. Biol. Chem., 1998, v. 273, s. 11 017-11 024.
  25. ↑ Tsien RY, Grynkiewicz G., Poenie M. Uusi sukupolvi Ca2+-indikaattoreita, joilla on huomattavasti parannetut fluoresenssiominaisuudet // J. Biol. Chem., 1985, v. 260, s. 3440-3450.
  26. ↑ Cannell MB, Berlin JR, Lederer WJ Solunsisäinen kalsium sydämen myosyyteissä: kalsiumtransientit mitattu fluoresenssikuvauksella // Soc. Gen. fysiol. Ser., 1987, v. 42, s. 201-214.
  27. ↑ Haugland R. Molekyylikoettimien käsikirja: opas fluoresoiviin koettimiin ja leimaustekniikoihin // . ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA, 2010 s. 99-121. Käyttötila: https://www. thermofisher.com/uk/en/home/references/molecular-probes-the-handbook.html. Haettu 6. kesäkuuta 2018.
  28. ↑ Cheng H., Lederer MR, Xiao RP, Gómez AM, Zhou YY, Ziman B., Spurgeon H., Lakatta EG, Lederer WJ Excitation-contraction coupling in heart: new insights from Ca2+ sparks // Cell Calcium, 1996, v . 20, s. 129-140.
  29. ↑ Chawla S., Skepper JN, Hockaday AR, Huang, CL-H. Hypertonisten liuosten aiheuttamat kalsiumaallot koskemattomissa sammakon luurankolihaskuiduissa // J. Physiol., 2001, v. 536, s. 351-359.
  30. ↑ Goddard CA, Ghais NS, Zhang Y., Williams AJ, Colledge WH, Grace AA, Huang CL-H. P2328S-mutaation fysiologiset seuraukset ryanodiinireseptorigeenissä (RyR2) geneettisesti muunnetuissa hiiren sydämissä // Acta Physiol., 2008, v. 194, s. 123-140.
  31. ↑ 1 2 Cody CW, Prasher DC, Westler WM, Prendergast FG, Ward WW Aequorea vihreän fluoresoivan proteiinin heksapeptidikromoforin kemiallinen rakenne // Biochemistry, 1993, v. 32, s. 1212-1218.
  32. ↑ Tsien RY, Paradiso AM, Machen TE Na±H+-vaihto maharauhasissa mitattuna sytoplasmaan kiinnitetyllä, fluoresoivalla pH-indikaattorilla // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1984, v. 81, s. 7436-7440.
  33. ↑ Zucker RS ​​​​Fotolabiilien kalsiumkelaattoreiden vaikutukset fluoresoiviin kalsium-indikaattoreihin // Cell Calcium, 1992, v. 13, s. 29-40.
  34. ↑ Tsien RY, Zucker RS ​​​​Sytoplasmisen kalsiumin hallinta fotolabiililla tetrakarboksylaatti-2-nitrobentshydrolikelaattoreilla // Biophys. J., 1986, v. 50, s. 843-853.
  35. ↑ Gurney AM, Tsien RY, Lester HA Kaliumvirran aktivointi nopeilla fotokemiallisesti generoiduilla solunsisäisen kalsiumin lisäyksillä rotan sympaattisissa hermosoluissa // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1987, v. 84, s. 3496-3500.
  36. ↑ Tsien RY, Furuta T., Wang SS-H., Dantzker JL, Dore TM, Bybee WJ, Callaway EM, Denk W. Bromatut 7-hydroksikumarin-4-yylimetyylit: valoherkät suojaryhmät, joilla on biologisesti käyttökelpoinen poikkileikkaus kahdelle fotonifotolyysi // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1999, v. 96, s. 1193-1200.
  37. ↑ Tsien RY, Adams SR, Harootunian AT, Buechler YJ, Taylor SS Syklisen AMP:n fluoresenssisuhdekuvantaminen yksittäisissä soluissa // Nature, 1991, v. 349, s. 694-697.
  38. ↑ Tsien RY, Civitelli R., Bacskai BJ, Mahaut-Smith MP, Adams SR, Avioli LV Yksisoluinen analyysi syklisestä AMP-vasteesta lisäkilpirauhashormonille osteoblastisissa soluissa // J. Bone Min. Res., 1994, v. 9, s. 1407-1417.
  39. ↑ Tsien RY, Sammak PJ, Adams SR, Harootunian AT, Schliwa M. Solunsisäinen syklinen AMP, ei kalsium, määrittää rakkuloiden liikkeen suunnan melanoforeissa: suora mittaus fluoresenssisuhteen kuvantamisella // J. Cell Biol., 1992, v. 117, s. 57-72.
  40. ↑ Tsien RY, Bacskai BJ, Hochner B., Mahaut-Smith M., Adams SR, Kaang BK, Kandel ER CAMP- ja proteiinikinaasi A -alayksiköiden spatiallyled dynamics in Aplysia sensory neurons // Science, 1993, v. 260, s. 222-226.
  41. ↑ Morise H., Shimomura O., Johnson FH, Winant J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea // Biochemistry, 1974, v. 13, s. 2656-2662.
  42. ↑ Shimomura O. Aequorean vihreän fluoresoivan proteiinin kromoforin rakenne // FEBS Lett., 1979, v. 104, s. 220-222.
  43. ↑ Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ Aequorea victorian vihreän fluoresoivan proteiinin primaarirakenne // Gene, 1992, v. 111, s. 229-233.
  44. ↑ 1 2 Heim TR, Prasher DC, Tsien RY Vihreä-fluoresoivan proteiinin aallonpituusmutaatiot ja translaation jälkeinen autoksidaatio. Proc. Natl Acad. sci. USA, 1994, v. 91, s. 12501-12504.
  45. ↑ 1 2 Tsien RY, Heim R. Vihreän fluoresoivan proteiinin suunnittelu parantaa kirkkautta, pidempiä aallonpituuksia ja fluoresenssiresonanssienergian siirtoa // Curr. Biol., 1996, v. 6, s. 178-182.
  46. ↑ Cormack BP, Valdivia RH, Falkow, S. Vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) FACS-optimoidut mutantit // Gene, 1996, v. 173, s. 33-38.
  47. ↑ Tsien RY, Brejc K., Sixma TK, Kitts PA, Kain S.R. , Ormo M., Remington SJ Rakenneperusta Aequorea victorian vihreän fluoresoivan proteiinin kaksoisviritykselle ja fotoisomeraatiolle. Proc. Natl. Acad. sci. USA, 1997, v. 94, s. 2306-2311.
  48. ↑ Tsien RY, Vergara J., Delay M. Inositoli 1,4,5-trisfosfaatti: mahdollinen kemiallinen linkki virityssupistuksen kytkennässä lihaksessa // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1985, v. 82, s. 6352-6356.
  49. ↑ Randriamampita C., Tsien RY Kalsiumin sisäänvirtaustekijän (CIF) hajoaminen voidaan estää fosfataasin estäjillä tai Ca2+:n kelataatiolla // J. Biol. Chem., 1995, v. 270, s. 29-32.
  50. ↑ Putney JW Kauppakäyttöisten kalsiumin syöttövälittäjien STIM ja Orai muodot ja toiminnot // Adv. Biol. Asetus, 2017, v. 68, s. 88-96.
  51. ↑ Huang CL-H., Pedersen TH, Fraser JA. Vastavuoroiset dihydropyridiini- ja ryanodiinireseptorivuorovaikutukset luurankolihasten aktivaatiossa // J. Muscle Res. Cell Motil., 2011, v. 32, s. 171-202.
  52. ↑ Tsien RY, Miyawaki A., Llopis J., Heim R., Michael McCaffery J., Adams JA, Ikura M. Ca2+:n fluoresenssiindikaattorit, jotka perustuvat vihreään fluoresoiviin proteiineihin ja kalmoduliiniin // Nature, 1997, v. 388, s. 882-887.
  53. ↑ Tsien RY, Miyawaki A., Griesbeck O., Heim R. Dynaamiset ja kvantitatiiviset Ca2+-mittaukset käyttämällä parannettuja kameleoneja // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1999, v. 96, s. 2135-2140.
  54. ↑ Zaccolo M., Pozzan T. Erilliset mikrodomeenit, joissa on korkea cAMP-pitoisuus stimuloiduissa rotan vastasyntyneiden sydämen myosyyteissä // Science, 2002, v. 295, s. 1711-1715.
  55. ↑ Zhang J., Allen MD FRET-pohjaiset biosensorit proteiinikinaaseille: kinomin valaiseminen // Mol. Biosyst., 2007, v. 3, s. 759-765.
  56. ↑ Shaner NC, Patterson GH, Davidson MW Advances in fluorescent protein technology // J. Cell Sci., 2007, v. 120, s. 4247-4260.
  57. ↑ Tsien RY, Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BNG, Palmer AE Parannetut monomeeriset punaiset, oranssit ja keltaiset fluoresoivat proteiinit, jotka on johdettu Discosoma sp. punainen fluoresoiva proteiini // Nat. Biotechnol., 2004, v. 22, s. 1567-1572.
  58. ↑ Tsien RY, Rodriguez E., Campbell R., Lin J., Lin M., Miyawaki A., Palmer A., ​​Shu X., Zhang J. Fluoresoivien ja fotoaktiivisten proteiinien kasvava ja hehkuva työkalupakki // Trends Biochem. Sc., 2016, v. 42, s. 111-129.
  59. ↑ Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, Savitsky AP, Zaraisky AG, Markelov ML, Lukyanov SA Fluoresoivat proteiinit ei-bioluminoivista Anthozoa-lajeista // Nat. Biotechnol., 1999, v. 17, s. 969-973.
  60. ↑ Wall MA, Socolich M., Ranganathan R. Punaisen fluoresenssin rakenteellinen perusta tetrameerisessä GFP-homologissa DsRed, Nat. Rakenne. Biol., 2000, v. 7, s. 1133-1138.
  61. ↑ Yarbrough D., Wachter RM, Kallio K., Matz MV, Remington SJ DsRedin, korallin punaisen fluoresoivan proteiinin, puhdistettu kiderakenne 2,0-Å resoluutiolla // Proc. Natl Acad. sci. USA, 2001, v. 98, s. 462-467.
  62. ↑ Campbell R., Tsien R.Y., Tour. O., Palmer A., ​​​​Steinbach P., Baird GS, Zacharias D. Monomeerinen punainen fluoresoiva proteiini // Proc. Natl Acad. sci. USA, 2002, v. 99, s. 7877-7882.
  63. ↑ Tsien RY, Gonzalez JE Parannetut solukalvopotentiaalin indikaattorit, jotka käyttävät fluoresenssiresonanssienergian siirtoa // Chem. Biol., 1997, v. 4, s. 269-277.
  64. ↑ Hussain T., Tsien R.Y. et ai. Fluoresoivasti leimattu peptidi lisää degeneroituneiden kasvohermon haarojen tunnistamista leikkauksen aikana ja parantaa toiminnallista lopputulosta // PLoS ONE, 2015, v. 10, e0119600.
  65. ↑ Tsien R.Y. et ai. Ääreishermoja korostavan peptidin laminiinikohdistus mahdollistaa degeneroituneen hermon visualisoinnin // Proc. Natl. Acad. sci. USA, 2016, v. 113, s. 12 774-12 779
  66. ↑ Glasby MA, Gschmeissner SG, Hitchcock RJI, Huang CL-H. Rotan lihassiirteiden kautta tapahtuvan hermoregeneraation riippuvuus tyvikalvon saatavuudesta ja suunnasta // J. eurocytol., 1986, v. 15, s. 497-510.
  67. ↑ Gattuso JM, Davies AH, Glasby MA, Gschmeissner SE, Huang CL-H. Ääreishermon korjaus käyttämällä lihasten omasiirteitä: siirron palautuminen kädellisissä // J. Bone Jt Surg. Ser. B, 1988v. 70, s. 524-529.
  68. ↑ Tsien R.Y. et ai. 18F-positroneja emittoivat/fluoresoivat erytrosyytit mahdollistavat sisäisen verenvuodon kuvantamisen hiiren kallonsisäisen verenvuodon mallissa // J. Cereb. Blood Flow Metab., 2017, v. 37, s. 776-786.
  69. ↑ Smith JM, Bradley DP, James MF, Huang CL-H. Aivokuoren leviämisen fysiologiset tutkimukset // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc., 2006, v. 81, s. 457-481.
  70. ↑ Tsien R.Y. et ai. Levyepiteelikarsinooman varhainen havaitseminen karsinogeenin aiheuttamassa suun syövän jyrsijämallissa ratiometrisillä aktivoiduilla soluihin tunkeutuvilla peptideillä // Oral Oncol., 2017, v. 71, s. 156-162.
  71. ↑ Tsien RY, Malone CD, Olson ES et ai. Kasvaimen havaitseminen 3 teslassa aktivoidulla soluun läpäisevällä peptididendrimeerillä (ACPPD-Gd), T1-magneettiresonanssilla (MR) olevalla molekyylikuvausaineella // PLoS ONE. (http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0137104)
  72. ↑ Tsien R.Y. et ai. Kasvaimen radioherkistys monometyyliauristatiini E:llä: vaikutusmekanismi ja kohdennettu toimitus // Cancer Res., 2015, v. 75, s. 1376-1387.

Linkit

  Siirry Wikidata-kohteeseen  Temaattiset sivustot
Sanakirjat ja tietosanakirjat
Sukututkimus ja nekropolis
 Lääketieteen Wolf-palkinnon saajat
  • Matematiikka
  • Taide
  • Kemia
  • Fysiikka
  • Lääke
  • Maatalous