RNA -lämpömittari tai RNA -lämpöanturi ( eng. RNA thermometer, RNA thermosensor, RNAT ) on lämpötilaherkkä ei-koodaava RNA , joka osallistuu geenin ilmentymisen säätelyyn . RNA -lämpömittarit säätelevät pääsääntöisesti geenejä , jotka ovat välttämättömiä reagoimaan lämpöön tai kylmäshokkiin , mutta niiden osallistuminen pitkittyneen nälänhädän ja patogeenisyyden säätelyyn on osoitettu [1] .
RNA - lämpömittarin toimintaperiaate on muuttaa tämän molekyylin toissijaista rakennetta vasteena lämpötilan muutokselle . Näiden rakenteellisten muutosten aikana tämän RNA:n tärkeät osat, esimerkiksi ribosomin sitoutumiskohta , paljastuvat tai päinvastoin menevät syvälle molekyyliin, mikä vaikuttaa lähellä olevan proteiinia koodaavan geenin translaatioon .
RNA-lämpömittarit yhdessä ribokytkimien kanssa tukevat RNA-maailman hypoteesia . Tämän teorian mukaan aluksi ainoa soluissa esiintyvä nukleiinihappo oli RNA, joka myöhemmin korvattiin nykyaikaisella DNA → RNA → proteiinijärjestelmällä [2] .
Esimerkkejä RNA-lämpömittareista ovat FourU [3] , cis -säätelyelementti Hsp90 [4] , ROSE elementti [5] , Hsp17 lämpömittari [6] .
Ensimmäisen lämpötilaherkän RNA-elementin löydöstä raportoitiin vuonna 1989 [7] . Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatiot ylävirtaan translaation aloituskohdasta lambdafaagin (λ) mRNA: ssa cIII :ssa vaikuttavat proteiinin cIII translaatiotasoon [8] . Tämä proteiini osallistuu λ-faagin elinkaaren ohjelman ( lyyttinen tai lysogeeninen reitti) valintaan, ja korkea cIII-proteiinipitoisuus vastaa lysogeenistä reittiä [8] . Lisätutkimukset osoittivat, että tällä ylävirran RNA-alueella on kaksi vaihtoehtoista sekundaarirakennetta. Kävi ilmi, että nämä rakenteet eivät ole keskenään vaihdettavissa ja riippuvat Mg 2+ -ionien pitoisuudesta ja lämpötilasta [7] [9] . Nyt uskotaan, että nämä RNA-lämpömittarit laukaisevat lyyttisen reitin lämpöshokkiolosuhteissa, jotta bakteriofagi voi nopeasti replikoitua ja poistua isäntäsolusta [1] .
Termiä "RNA-lämpömittari" käytettiin vasta vuonna 1999 [10] , jolloin Escherichia coli -bakteerin RNA-elementti rpoH nimettiin sellaiseksi [11] . Viime aikoina on tunnistettu useita uusia mahdollisia RNA-lämpömittareita käyttämällä bioinformatiikan tekniikoita [12] . Tässä tapauksessa tavallinen sekvenssihaku on tehotonta, koska RNA-lämpömittarien sekundaarirakenne on paljon konservatiivisempi kuin niiden nukleotidisekvenssit [12] .
RNA-lämpömittarien toiminnan tutkimiseen käytetään erilaisia lähestymistapoja. RNA-lämpömittarien dynamiikan tutkimiseksi voidaan korvata tietyissä kohdissa tavalliset nukleotidit fluoresoivilla ja siten tarkkailla niiden muutoksia [13] . RNA-lämpömittarin sijainnin määrittämiseksi tutkittavassa sekvenssissä tietyissä lämpötiloissa kehitettiin erityinen verkkopalvelin RNAthermsw [14] . Bakteerien RNA-lämpömittareiden tunnistamiseen käytetään myös geneettisiä menetelmiä, esimerkiksi Tet-Trap [15] .
Suurin osa tällä hetkellä tunnetuista RNA-lämpömittareista sijaitsee lämpöshokkiproteiineja koodaavien prokaryoottisten mRNA:iden 5'-transloitumattomilla alueilla (5'-UTR) . Ehkä nämä tulokset johtuvat valintaharhasta ja ylitsepääsemättömistä vaikeuksista löytää lyhyitä ei-konservatiivisia sekvenssejä genomitiedoissa [16] [17] .
Vaikka useimmat tunnetut RNA-lämpömittarit on löydetty prokaryooteista (mukaan lukien syanobakteerit [18] ), mahdollisia RNA-lämpömittareita on tunnistettu nisäkkäistä , mukaan lukien ihmiset [19] . Ihmisillä oletettu lämpösensorin lämpösokki RNA-1 (HSR1) aktivoi lämpösokkitranskriptiotekijä-1 (HSF1) ja laukaisee suojaavien proteiinien synteesin yli 37 °C:n lämpötiloissa ( normaali ruumiinlämpötila ) ja suojaa siten kennoja ylikuumenemiselta [19] . Cis - säätelyelementti Hsp90 säätelee hsp90- chaperonin ilmentymistä Drosophilassa ja lisää sen translaatiota korkeissa lämpötiloissa [4] .
RNA-lämpömittarien rakenne on yksinkertainen ja voidaan muodostaa lyhyillä RNA-sekvensseillä. Pienin tunnettu RNA-lämpömittari on 44 nukleotidia pitkä. Se sijaitsee syanobakteerin Synechocystis sp. lämpösokkiproteiinin (hsp17) mRNA:ssa. PCC 6803 [6] . Yleensä RNA-lämpömittarit ovat pituudeltaan 60-110 nukleotidia [21] , ja ne sisältävät yleensä hiusneulan , jossa pieni osa emäksistä on parittomia . Ne vähentävät rakenteen vakautta, minkä vuoksi se voi helposti sulaa lämpötilan noustessa [16] .
ROSE RNA -lämpömittarin yksityiskohtainen rakenneanalyysi osoitti, että yhteensopimattomat emäkset todella osallistuvat epästandardiseen emäspariin, joka ylläpitää RNA:n kierteistä rakennetta. Näitä epätavallisia pareja edustavat G -G , U -U ja U C -U -parit . Koska nämä ei-kanoniset parit ovat suhteellisen epävakaita, lämpötilan nousu aiheuttaa RNA:n paikallista fuusiota tällä alueella, mikä paljastaa Shine-Dalgarno-sekvenssin [20] .
Jotkut RNA-lämpömittarit ovat paljon monimutkaisempia kuin yksi hiusneula, kuten CspA-mRNA:n 5'-UTR:n tapauksessa, jossa RNA-lämpömittari sisältää pseudokossin ja monia hiusneuloja [22] [23] .
Keinotekoisia RNA-lämpömittareita, jotka sisältävät vain yhden hiusneulan, on kehitetty [24] . Tällaisten lyhyiden RNA-lämpömittarien nukleotidisekvenssi voi kuitenkin olla herkkä mutaatioille, ja yhden emäksen substituutio voi tehdä tämän RNA-lämpömittarin inaktiiviseksi in vivo [25] .
RNA-lämpömittarit sijaitsevat mRNA:n 5'-UTR:ssa, ylävirtaan koodaavasta sekvenssistä [1] . Toisin kuin riboswitchit, jotka toimivat transkription , translaation ja mRNA:n stabiilisuuden säätelyn tasolla, kaikki tällä hetkellä tunnetut RNA-lämpömittarit toimivat translaation aloitustasolla [26] . Rakenteelliset muutokset RNA-lämpömittareissa voivat poistaa ribosomin sitoutumiskohdan syvälle molekyyliin ja siten estää mRNA:n translaation proteiiniksi [16] . Lämpötilan noustessa RNA-lämpömittarin hiusneularakenne voi sulaa paljastaen ribosomin sitoutumiskohdan tai Shine-Dalgarno-sekvenssin (ja joissakin tapauksissa aloituskodonin AUG [18] ), jolloin ribosomin pieni alayksikkö ( 30S ) sitoutumaan mRNA:han seuraten, mitä koko lähetyslaitteisto aikoo [1] . Aloituskodoni , joka sijaitsee yleensä 8 nukleotidia alavirtaan Shine-Dalgarno-sekvenssistä [16] , merkitsee proteiinia koodaavan alueen alkua , jonka ribosomi muuntaa peptidiksi . Näiden cis - toimivien RNA-lämpömittarien lisäksi tunnetaan ainoa transaktiossa toimiva RNA-lämpömittari, joka sijaitsee RpoS- mRNA:ssa , jossa sen oletetaan säätelevän vastetta pitkittyneeseen nälkään [1] .
Esimerkkinä kannattaa harkita FourU Salmonella enterica RNA -lämpömittaria [3] . Yli 45 °C lämpötilojen vaikutuksesta Shine-Dalgarno-sekvenssin sisältävä hiusneula sulaa, Shine-Dalgarno-sekvenssi muuttuu pariutumattomaksi ja mRNA:n translaatio tulee mahdolliseksi [25] . On osoitettu, että FourU:n stabiilisuuteen vaikuttaa Mg 2+ -pitoisuus [27] . Tutkituin on RNA-lämpömittari, joka sijaitsee rpoH -geenin mRNA: ssa E. colissa [28] . Tämä lämpöanturi säätelee positiivisesti lämpöshokkiproteiinien translaatiota korkeissa lämpötiloissa erikoistuneen sigmatekijän σ 32 avulla [10] .
Rhizobiales -lahkon proteobakteereissa Bradyrhizobium japonicum ja Rhizobium radiobacter on kuvattu RNA-lämpömittarit ROSE 1 ja ROSE AT2 , vastaavasti. Ne sijaitsevat HspA :n 5'-UTR:ssa ja estävät lämpösokkiproteiinien translaatiota fysiologisissa lämpötiloissa [5] [29] .
Vaikka RNA-lämpömittarit yhdistetään yleensä lämpösokkiproteiinien ilmentymiseen, ne voivat myös säädellä kylmäsokkiproteiinien ilmentymistä [22] . Esimerkiksi termofiilisessä bakteerissa Thermus thermophilus kahden 7 kDa :n proteiinin ilmentymistä säätelee RNA-lämpömittari [30] , ja samanlainen mekanismi on kuvattu myös Escherichia colissa [23] .
Patogeenit voivat käyttää RNA-lämpömittareita, jotka reagoivat 37 °C:seen , aktivoimaan infektioon liittyviä geenejä . Esimerkiksi siirtämällä vihreää fluoresoivaa proteiinia koodaava geeni prfA -geenin 5'-päähän , joka koodaa virulenssigeenien keskeistä transkription säätelijää Listeria monocytogenesissä , prfA :n ilmentymisen positiivinen säätely osoitettiin : tällaisen hybridigeenin transkriptio T7 - promoottorista E. colin fluoresenssi havaittiin 37 °C:ssa, mutta ei 30 °C:ssa [31] . RNA-lämpömittarit ovat mukana tällaisten patogeenisten bakteerien, kuten Leptospira interrogans ja Vibrio cholerae [32] , virulenssin säätelyssä . Patogeenisessä Shigella dysenteriae -bakteerissa ja Escherichia coli -bakteerin patogeenisissä kannoissa RNA-lämpömittarit ovat mukana patogeneesiin vaikuttavien prosessien säätelyssä [18] [33] [34] .
Joskus operonia voidaan säädellä useilla RNA-lämpömittareilla. On ennustettu, että E. colin ibpAB- operoni sisältää kaksi yhteistoiminnallista RNA-lämpömittaria: ROSE-elementin ja IbpB-lämpömittarin [35] .
On myös huomattava, että RNA-lämpömittareita voidaan käyttää paitsi yhden Shine-Dalgarno-sekvenssin sisältävien monokistronisten transkriptien translaation säätelyyn, myös monikistronisiin transkripteihin, jotka sisältävät useita Shine-Dalgarno-sekvenssejä [18] . Esimerkiksi Pseudomonas putida vastustuskykyä stressille tarjoaa trikistronic operoni, joka on säilynyt monien vapaasti elävien bakteerien keskuudessa. Tämän operonin kahta ensimmäistä geeniä säätelevät RNA-lämpömittarit [36] .
RNA-maailman hypoteesi väittää, että alun perin RNA toimi perinnöllisen tiedon kantajana ja suoritti entsymaattisia prosesseja, ja erilaiset RNA-sekvenssit toimivat biokatalyytteinä , säätelijöinä ja antureina [37] . Myöhemmin valinnan vaikutuksesta useimmat RNA:n suorittamista toiminnoista alkoivat suorittaa muut biomolekyylit , ja yksinomaan RNA:han perustuva elämä korvattiin DNA :han , RNA:han ja proteiiniin perustuvalla elämällä [2] .
Uskotaan, että RNA-lämpömittarit ja ribokytkimet ovat evoluutionaalisesti ikivanhoja alkuaineita, koska ne ovat yleisiä evoluutionaalisesti kaukaisimmissa organismeissa [38] . On ehdotettu, että RNA-maailmassa RNA-lämpömittarit säätelivät muita RNA:ita lämpötilasta riippuvaisesti [2] [39] . Nykyaikaisissa organismeissa RNA-lämpömittarit ovat mahdollisesti " molekyylifossiileja ", jotka olivat paljon yleisempiä RNA:n entisessä maailmassa kuin nykyään [2] .
Geeniekspression lämpötilan säätelyyn bakteereissa kehitetään keinotekoisia RNA-lämpömittareita [40] [24] .
Vuonna 2013 kehitettiin "termotsyymejä" - keinotekoisia RNA-lämpömittareita, joissa on ribotsyymiaktiivisuutta . Lämpösensorinen hiusneula sulassa tilassa estää ribotsyymin toimintaa, joka vapauttaa ribosomin sitoutumissekvenssin. Korotetuissa lämpötiloissa hiusneula sulaa, ribotsyymi inaktivoituu ja geenien ilmentyminen tukahdutetaan. Siten termotsyymi reagoi kohonneisiin lämpötiloihin päinvastoin kuin luonnolliset RNA-lämpömittarit [41] .
Vuonna 2016 raportoitiin "lämpökytkimien" luomisesta - lämpötilaherkkien RNA-lämpömittarien ja riboswitch- aptameerien integroimisesta yhdeksi rakenteeksi. Lämpökytkimet toimivat alhaisissa lämpötiloissa ribokytkiminä ja reagoivat sitoutumiseen ligandinsa kanssa muuttamalla rakennetta, ja korkeissa lämpötiloissa ne menevät pysyvästi "päällä"-tilaan. Näin ollen lämpökytkimet ovat ensimmäiset RNA-lämpömittarit, jotka toimivat transkription tasolla . Tällaisia keinotekoisia RNA-säätelyaineita voidaan käyttää laajasti geeniekspression säätelyyn [26] .
Vuonna 2016 ehdotettiin RNAiFold2T-algoritmia spesifisten IRES:tä sisältävien RNA-lämpömittareiden kehittämiseen. Tällaisten thermo-IRES-elementtien korkista riippumaton translaatio on noin 50 % voimakkaampi 42 °C:ssa kuin 30 °C:ssa. Niiden translaatiotehokkuus on kuitenkin edelleen pienempi kuin villityypin IRES:n, joka ei riipu lämpötilasta [42] .
| RNA:n tyypit | |
|---|---|
| Proteiinin biosynteesi | |
| RNA:n käsittely |
|
| Geeniekspression säätely |
|
| cis-säätelyelementtejä | |
| Parasiittiset elementit | |
| Muut |
|