ADP-ribosylaatio ( ADP-ribosylaatio ) on kemiallinen reaktio , jossa proteiiniin lisätään yksi tai useampi ADP -ribosylaatio [1] [2] . Se on palautuva translaation jälkeinen modifikaatio , jolla on tärkeä rooli monissa soluprosesseissa , kuten signaalinsiirrossa , DNA:n korjauksessa , geeniekspression säätelyssä ja apoptoosissa [3] [4] . Virheellistä ADP-ribosylaatiota on havaittu joissakin syövän muodoissa [5] . Monet bakteeritoksiinit , kuten koleratoksiini ja difteriatoksiini , vaikuttavat ADP-ribosylaatioon [6] .
Ensimmäiset oletukset sellaisen proteiinien translaation jälkeisen muunnelman olemassaolosta, kuten ADP-ribosylaatio, ilmestyivät 1960-luvulla. Tänä aikana Pierre Chambon ja hänen työtoverinsa huomasivat, että kanansiemenuute omaksui ATP :n [7] . Myöhemmät tutkimukset osoittivat, että ADP-riboosi, NAD + : n johdannainen , tuli reaktioon . Muutamaa vuotta myöhemmin tunnistettiin entsyymi , joka kiinnittää ADP-riboosin proteiineihin, ja sitä kutsuttiin poly(ADP-riboosi)polymeraasiksi . Aluksi poly-(ADP-riboosin) ajateltiin olevan lineaarinen ADP-riboositähteiden ketju, jotka on yhdistetty glykosidisilla sidoksilla . Myöhemmin osoitettiin, että joka 20-30 jäännös ketju voi haarautua [8] .
Mono-ADP-ribosylaatio kuvattiin muutama vuosi myöhemmin, kun havaittiin, että NAD + vaadittiin, jotta difteriatoksiini olisi aktiivinen . Toksiini aktivoituu, kun yksi ADP-riboositähde on kiinnittynyt siihen mono-ADP-ribosyylitransferaasientsyymin toimesta. Aluksi poly-ADP-ribosylaation uskottiin liittyvän vain geeniekspression säätelyyn. Kuitenkin, kun uusia ADP-ribosylaatiota suorittavia entsyymejä löydettiin, tämän modifikaation monipuolinen toiminnallinen merkitys tuli ilmeiseksi. Vaikka ensimmäinen tunnettu nisäkäsentsyymi , joka kykenee suorittamaan poly-ADP-ribosylaatiota, löydettiin 1980-luvun lopulla, seuraavat nisäkäsproteiinit , joilla oli tällainen aktiivisuus, kuvattiin vasta 15 vuotta myöhemmin [9] . 1980-luvun lopulla löydettiin myös ADP-ribosyylisyklaasi-entsyymit, jotka katalysoivat syklisen ADP-riboosin lisäämistä proteiineihin. Kävi ilmi, että sirtuiiniperheen proteiineilla , jotka voivat katalysoida NAD + -riippuvaista deasetylaatiota , on myös mono-ADP-ribosyylitransferaasiaktiivisuutta [10] [11] .
Yleensä NAD + toimii ADP-riboositähteiden lähteenä . Tässä siirtoreaktiossa NAD + :n N-glykosidisidos, joka sitoo ADP-riboosin nikotiiniamidiryhmään , katkeaa, minkä jälkeen modifioidun aminohapon sivuryhmä suorittaa nukleofiilisen hyökkäyksen. ADP-ribosyylitransferaasit katalysoivat kahden tyyppisiä reaktioita: mono-ADP-ribosylaatiota ja poly-ADP-ribosylaatiota.
Mono-ADP-ribosyylitransferaasit katalysoivat yleisimmin yksittäisen ADP-riboositähteen lisäämistä arginiinin sivuketjuun spesifisen motiivin (RS-EXE) kautta. Ensinnäkin ADP-riboosin ja nikotiiniamidin välinen sidos katkeaa, kun muodostuu oksonium-ioni . Modifioidun proteiinin arginiinisivuketju toimii sitten nukleofiilina ja hyökkää oksoniumionin vieressä olevaan elektrofiiliseen hiiliatomiin . Ennen nukleofiilistä hyökkäystä arginiini deprotonoi entsyymiglutamaattijäännöksellä Toinen konservatiivinen glutamaattitähde muodostaa vetysidoksen yhden riboosihydroksyyliryhmän kanssa , mikä helpottaa nukleofiilistä hyökkäystä. Sidoksen katkeamisen seurauksena nikotiiniamidia vapautuu. Modifikaatio voidaan poistaa ADP-ribosyylihydrolaasientsyymeillä, jotka rikkovat N-glykosidisidoksen arginiinin ja riboosin välillä vapauttaen ADP-riboosia ja modifioimatonta proteiinia. NAD + ei kuitenkaan muodostu käänteisessä reaktiossa [12] .
Poly(ADP-riboosi)polymeraaseja ( eng. poly- (ADP-riboosi)polymeraasit, PARP ) löytyy pääasiassa eukaryooteista ja ne katalysoivat useiden ADP-riboositähteiden lisäämistä proteiiniin. Kuten mono-ADP-ribosylaatiossa, ADP-riboosin lähde on NAD + . PARP:t käyttävät His - Tyr -Glu- katalyyttistä triadia tehostamaan sitoutumista NAD + :aan ja kiinnittämään kootun poly-ADP-riboosiketjun proteiiniin. Glutamaattijäännös helpottaa O-glykosidisidoksen muodostumista kahden riboositähteen välille [13] . On olemassa useita muita entsyymejä, jotka tunnistavat poly-ADP-riboosiketjuja, hydrolysoivat niitä tai muodostavat haaroja. Yli 800 proteiinista on löydetty motiiveja, jotka voivat sitoutua poly-ADP-riboosiin vaihtelevalla vahvuudella. Siksi poly-ADP-ribosylaatio ei ainoastaan muuta proteiinin rakennetta ja konformaatiota , vaan se voi myös houkutella siihen muita proteiineja [14] .
Monien aminohappojen sivuketjut voivat toimia ADP-riboosiryhmän vastaanottajina. Kemiallisesti katsottuna poly-ADP-ribosylaatio on glykosylaatiota : aminohappojen sivuketjujen happi- , typpi- tai rikkiatomit voivat suorittaa nukleofiilisen hyökkäyksen, joka on välttämätön sidoksen muodostamiseksi riboosin kanssa ADP-riboosissa . [15] . Aluksi uskottiin, että ADP-glykosylaation kohteina olivat glutamaatti- ja aspartaattitähteet . Myöhemmin kuitenkin osoitettiin, että seriini [16] [17] , arginiini [18] , kysteiini [19] , lysiini [20] , diftamidi [21] , fosfoseriini [22] ja asparagiinitähteet voivat myös läpikäy ADP-ribosylaatio [23] .
PARP:t aktivoituvat DNA -vaurion tai solustressin aikana, mikä lisää poly-ADP-riboosin määrää ja vähentää NAD + :n määrää [24] . Yli 10 vuoden ajan uskottiin, että ainoa poly-ADP-polymeraasi nisäkässoluissa on PARP1 , joten kaikista poly-ADP-polymeraaseista tämä entsyymi on parhaiten tutkittu. Apoptoosin aikana aktivoidut kaspaasit leikkaavat PARP1:n kahdeksi fragmentiksi, inaktivoivat entsyymin täysin ja rajoittavat siten poly-ADP-riboosin muodostumista. Yksi tuloksena olevista fragmenteista siirtyy ytimestä sytoplasmaan ja, kuten yleisesti uskotaan, tulee oma- antigeeniksi . Toisessa ohjelmoidun solukuoleman muodossa , partanatoosissa , esiintyy poly-ADP-riboosin kerääntymistä PARP:n aktivoitumisen tai poly(ADP-riboosin) glykohydrolaasin - entsyymin, joka hydrolysoi poly- ADP-riboosi, jossa muodostuu vapaita ADP-ribooseja. Apoptoosin aikana poly-ADP-riboosi saa proteiineja siirtymään ytimeen, mikä laukaisee DNA:n fragmentoitumisen . PARP:n hyperaktivaatio johtaa nekroottiseen solukuolemaan, jota säätelee kasvainnekroositekijä . PARP-inhibiittorit vaikuttavat nekroptoosiin [25] toistaiseksi epäselvällä mekanismilla .
ADP-ribosylaatio voi vaikuttaa geenin ilmentymiseen melkein joka vaiheessa, mukaan lukien kromatiinin organisoitumisen, transkriptiotekijän sitoutumisen ja mRNA:n prosessoinnin kautta . PARP1 voi vaikuttaa kromatiinin rakenteeseen tuomalla translaation jälkeisiä modifikaatioita histonipyrstöihin . PARP:t voivat myös vaikuttaa transkriptiotekijöiden rakenteeseen ja niiden vuorovaikutukseen keskenään ja promoottorien kanssa . Esimerkiksi mono-ADP-ribosyylitransferaasi PARP14 vaikuttaa sitoutumiseen transkriptiotekijän STAT promoottoriin . Muut ADP-ribosyylitransferaasit modifioivat proteiineja, jotka ovat vuorovaikutuksessa mRNA:n kanssa, mikä voi johtaa vastaavien geenien hiljentymiseen [26] .
PARP:t voivat olla mukana korjaamassa yksi- ja kaksijuosteisia katkoksia DNA:ssa. Esimerkiksi PARP1 sitoutuu DNA:han yhden juosteen katkeamiskohdassa ja alkaa syntetisoida poly-ADP-riboosia, joka on vuorovaikutuksessa XRCC1- proteiinin kanssa . Se värvää katkaisukohtaan muita korjaamiseen osallistuvia proteiineja: polynukleotidikinaasi , joka prosessoi DNA:n päitä emäsleikkauksen korjauksen aikana , ja aprataksiini , joka osallistuu yksijuosteisten katkeamien korjaamiseen ja ei-homologisten päiden liittämiseen [27] .
PARP1 on mukana myös kaksisäikeisten katkeamien korjaamisessa, esimerkiksi ei-homologisissa päätyliitoksissa. Se myös todennäköisesti hidastaa replikaatiohaarukan liikettä DNA-vaurion jälkeen ja edistää homologista rekombinaatiota . Mahdollisesti PARP1 on mukana kaksisäikeisten katkosten korjaamisessa yhdessä PARP3 :n kanssa . Niiden yhteisen toiminnan luonteesta on olemassa kaksi hypoteesia. Ensinnäkin ne voivat toiminnallisesti korvata toisensa, kun toinen poly-ADP-ribosyylitransferaasi katoaa. Toisen hypoteesin mukaan PARP3 suorittaa mono-ADP-ribosylaatiota tai syntetisoi lyhyitä ketjuja poly-ADP-riboositähteistä ja aktivoi myös PARP1:n, joka täydentää ne pitkiksi ketjuiksi [28] .
Viallisten proteiinien solunsisäisen tuhoutumisen tärkein molekyylimekanismi on ubikitiini , proteasomijärjestelmä . ADP-ribosyylitransferaasitankyraasi ( TNKS ) on vuorovaikutuksessa proteasomiregulaattorin PI31 kanssa . Kuten Drosophilassa ja ihmissoluissa on osoitettu , TNKS:n ankyriinidomeeni helpottaa vuorovaikutusta PI31-proteiinin N-terminaalisen sitoutumismotiivin ja C-terminaalisen HbYX-domeenin kanssa. Tämä vuorovaikutus edistää tankyraasin PI31 PARP -domeenin ADP-ribosylaatiota . Lisäksi Drosophila-solujen käsittely TNKS- inhibiittorilla , joka tunnetaan nimellä XAV939, häiritsee proteasomin 26S- alayksikön toimintaa . Lisäksi poly-ADP-ribosyloitu PI31 ei voi enää inhiboida 20S-proteasomialayksikön a-alayksiköiden aktiivisuutta. Siten tankyraasin välittämä PI31:n poly-ADP-ribosylaatio vaikuttaa proteasomin toimintaan [29] .
Kuten edellä on käsitelty, PARP1 osallistuu yksi- ja kaksijuosteisten DNA-katkojen korjaamiseen ja säätelee myös apoptoosia. Tästä syystä solut, joilla on alentunut PARP1-aktiivisuus, ovat alttiita pahanlaatuisuudelle . Monet muut PARP:t häiritsevät myös syöpäsolujen muodostumista. PARP2 osallistuu DNA:n korjaamiseen, PARP3 säätelee senrosomien kaksinkertaistamista ja tankyraasi osallistuu telomeerien pituuden säätelyyn . Samaan aikaan PARP:n täydellinen estäminen on yksi tällä hetkellä käytetyistä lähestymistavoista syövän hoidossa , koska solut, joista on poistettu ainakin yksi PARP, kuolevat nopeasti. Esimerkiksi PARP1:n esto syöpäsoluissa aiheuttaa niiden kuoleman useiden DNA-vaurioiden vuoksi. PARP14 liittyy todennäköisesti B-solulymfoomien aggressiivisuuden asteeseen [5] .
Bakteerien ADP-ribosyloivat eksotoksiinit kiinnittävät kovalenttisesti ADP-riboositähteen NAD + :lla infektoituneen eukaryoottisen organismin proteiiniin. Esimerkiksi koleratoksiini ja yksi enterotoksiineista ADP-ribosyloivat heterotrimeeristen G-proteiinien a-alayksikköä . ADP-ribosyloidussa tilassa α-alayksikkö on jatkuvasti aktiivinen ja liittyy GTP :hen , joten cAMP syntetisoituu jatkuvasti solussa , mikä stimuloi veden ja ionien vapautumista suoliston epiteelin soluista . Clostridium botulinum C3-toksiini ADP-ribosyloi GTP:tä sitovia proteiineja Rho ja Ras , pertussistoksiini suorittaa myös G-proteiinien ADP-ribosylaatiota . Kurkkumätäpotilaissa translaation elongaatiotekijä EF-2 on ADP-ribosyloitunut , mikä häiritsee proteiinisynteesiä [6] . Näiden bakteerien lisäksi Pseudomonas aeruginosa -solut ( eksotoksiini A ) erittävät ADP:tä ribosyloivia toksiineja [30] .