Ohutkerroskromatografia

Ohut kerroskromatografia on kromatografinen menetelmä, jossa käytetään ohutta adsorbenttikerrosta paikallaan . Menetelmä perustuu siihen, että erotettavat aineet jakautuvat eri tavalla sorboivan kerroksen ja sen läpi virtaavan eluentin välillä , minkä seurauksena etäisyys, jolla nämä aineet siirtyvät kerrosta pitkin samaan aikaan, vaihtelee. Ohutkerroskromatografia tarjoaa erinomaiset mahdollisuudet aineiden analysointiin ja erottamiseen, koska sekä sorbentti että eluentti voivat vaihdella laajalla alueella. Levyjä, joilla on erilaisia ​​sorbentteja, on kaupallisesti saatavana, mikä mahdollistaa menetelmän käytön nopeasti ja rutiininomaisesti. Ohut kerroskromatografian variaatio on luotettavampi ja toistettavissa.korkean suorituskyvyn ohutkerroskromatografia , jossa käytetään erityisiä levyjä ja kehittyneitä laitteita.

Ohutkerroskromatografia löydettiin vuonna 1889, se kehittyi merkittävästi 1900-luvun puolivälissä ja sitä käytetään edelleen laajalti farmaseuttisella, lääketieteen, elintarvikealalla sekä akateemisessa ja teollisessa tieteessä.

Historia

Edellytyksenä menetelmän luomiselle oli Schönbeinin vuonna 1861 käyttämä paperikromatografia [1] . Tämä menetelmä kehitettiin Schönbeinin opiskelijan Goppelsrederin teoksissa 1800-luvun 80-luvulla [2] . Tuolloin käytettyä tekniikkaa kutsuttiin kapillaarianalyysiksi. Työ unohdettiin käytännössä, ja vuonna 1944 Consden ym. löysivät selluloosakromatografian uudelleen. Ohutkerroskromatografiamenetelmää, melkein siinä muodossa kuin se nykyään tunnetaan, käytti ensimmäisen kerran hollantilainen biologi Martin Beijerinck vuonna 1889. Tutkiessaan rikki- ja suolahappojen diffuusiota gelatiinissa Beyerink havaitsi , että suolahappo liikkui rikkihappoa nopeammin. Kokeissaan hän havaitsi suolahappovyöhykkeen lisäämällä kerrokseen hopeakloridiliuosta ja rikkihappovyöhykkeen lisäämällä bariumkloridiliuosta . Vuonna 1898 Wijsman sovelsi samanlaista menetelmää entsyymien määrittämiseen maltaiden diastaasissa ja käytti ensimmäisenä fluoresenssidetektiota ; menetelmän herkkyys tuolloin mahdollisti aineen läsnäolon määrittämisen 40 pg [3] . Tästä huolimatta sekä pylväskromatografiaa, jonka M. S. Tsvet kehitti 1900-luvun alussa, että ohutkerroskromatografiaa käytettiin varsinaisesti vasta 1930-luvulla [4] .

Vuonna 1938 Izmailov ja Schreiber kertoivat tekevänsä pyöreä kromatografia alumiinioksidikerroksella, joka on kerrostettu lasilevylle. Tässä tapauksessa erotettujen aineiden kerrokset olivat samankeskisiä ympyröitä. Tutkijat ovat osoittaneet, että menetelmää voidaan käyttää kolonnikromatografian sorbenttien ja eluien testaamiseen [3] .

Merkittävää edistystä TLC-menetelmän kehittämisessä saavuttivat J. Kirchner ja työtoverit, jotka vuosina 1945-1954 työskentelivät hajuaineiden eristämisessä sitrushedelmistä kromatografisilla menetelmillä. Vakuutettuina paperikromatografian soveltumattomuudesta omiin tarkoituksiinsa he kehittivät menetelmän, joka yhdisti paperin ja pylväskromatografian edut, mutta se ei herättänyt paljon huomiota ennen kuin Desaga ja Merck mainostivat sitä [3] .

1950-luvun puoliväliin asti menetelmän kuvaamiseen käytettiin termejä "liuskakromatografia", "levykromatografia", "ohutkalvokromatografia", "avoin pylväskromatografia", mutta termiä "ohutkerroskromatografia", jota E ehdotti. Stahl vuonna 1956 [5] osoittautui niin menestyksekkääksi, että se syrjäytti kaikki muut. Samoihin aikoihin arvovaltainen Chemical Abstracts -lehti valitsi tätä aihetta koskevat julkaisut erilliseksi hakemistoksi ja tunnusti sen itsenäiseksi analyyttisen kemian menetelmäksi [3] .

Kiinteä vaihe

Levyt, joissa oli sovellettu adsorptiokerros, ilmestyivät myynnissä vuonna 1961, ja ne ovat nyt käytännössä syrjäyttäneet käytöstä. Sorbentit, joiden hiukkaskoko on 10–20 um, levitetään substraattiin, yleensä lasi , muovista tai alumiinista . Kerroksen paksuus vaihtelee välillä 100-250 um (analyyttisille levyille) 2 mM (preparatiivisille levyille). Vakiolevyn muoto on 20x20 cm, mutta myös 10x20, 5x20 ja 2,5x5 cm: n muotoja on. Voit leikata tarvittavan koon levyn itse. Levyjä on saatavana myös kanavilla näytteen levityksen helpottamiseksi ja näytteen sekoittamisen estämiseksi. Levyt, joissa on predsorptiokerros, on valmistettu materiaalista, jolla on alhaisempi adsorbingikapasiteetti ( selluloosa , piimaan maa ). Tällaiset kerrokset palvelevat näytteen puhdistamista sekä kapean nauhan muodostamiseksi ennen kuin näyte saavuttaa erotuskerroksen [6] .

Levyjä korkean suorituskyvyn TLC:tä varten ehdotettiin vuonna 1975, ja niiden mitat ovat myös 10 × 20 ja 10 × 10 cm ja adsorptiokerroksen paksuus 200 µm. Tällaisilla levyillä on suurempi resoluutio, matalampi detektioraja ja ne vaativat vähemmän liuotinta eluointiin. Vuonna 1995 ilmestyi parannettuja korkean suorituskyvyn pallomaisia ​​hiukkaslevyjä. Vuonna 2001 markkinoille tarjottiin monoliittisella kerroksella varustettuja levyjä, joita käytettiin vain tieteellisessä tutkimuksessa [6] .

Useita materiaaleja on historiallisesti käytetty adsorbentteina: alumiinioksidi (hapan, neutraali ja emäksinen), piimaa (puhdistettu piimaa), polyamidit , kationinvaihtohartsit . Nämä materiaalit mainitaan edelleen oppikirjoissa ja tieteellisissä artikkeleissa, mutta ne ovat menettäneet merkityksensä ja niiden tuotanto on käytännössä pysähtynyt [6] .

Levyjen vahvistamiseen voidaan käyttää sideainetta. Aikaisemmin näihin tarkoituksiin, esimerkiksi Silicagel G:tä sisältävissä levyissä, käytettiin laajasti kipsiä 13 massaprosenttia. Nykyaikaisissa myynnissä olevissa levyissä käytetään orgaanisia sideaineita (esim. metakrylaattia). Tärkkelyksen ja karboksimetyyliselluloosan käyttöä kuvataan myös kirjallisuudessa . Itse asiassa sideaine on liikkumattoman faasin komponentti, joten erilaisten sitovien aineiden käyttö voi johtaa erilaisiin kromatografiatuloksiin [6] .

Ainevyöhykkeiden sijaintien määrittämiseksi adsorptiokerrokseen voidaan viedä adsorptiokerrokseen fluoresoiva indikaattori. Kun tällaista kerrosta säteilytetään ultraviolettisäteilyllä , jonka aallonpituus on 254 nm, se antaa vihreän (F 254 ) tai vaalean sinisen (F 254 s ) hehkun. Tässä tapauksessa ultraviolettivaloa absorboivan aineen vyöhyke näyttää tummalta fluoresoivan kerroksen taustalla [6] .

Silikageeli

Yksi tärkeimmistä kiinteän faasin materiaaleista on silikageeli, jota käytetään yli 90 %:ssa ohutkerroskromatografian sovelluksista. Silikageeliä saadaan happosaostuksella silikaattiliuoksista tai piijohdannaisten hydrolyysillä . _ Syntyvien hiukkasten halkaisija riippuu olosuhteista, esimerkiksi pH :ta muuttamalla voidaan saada silikageeliä, jonka pinta-ala on 200-800 m²/g. Kemiallisesti silikageelin pinta sisältää siloksaania (Si-O-Si) ja silanoliryhmiä (Si-OH). Silanoliryhmät voivat olla vapaita, vikinaalisia tai geminaalisia. Ne voivat myös olla vuorovaikutuksessa toistensa kanssa muodostamalla vetysidoksia [6] .

Näin ollen silikageelille on tunnusomaista monet muuttuvat parametrit, joiden säätö voi olla erilainen eri valmistajilla. Siitä huolimatta on kehitetty menetelmiä pallomaisen silikageelin saamiseksi, jolla on tietyn kokoiset huokoset. Monien laatujen huokoskoko on 60 Å ja niistä käytetään nimitystä "silikageeli 60" [6] .

Silikageelillä on erittäin korkea affiniteetti veteen ja se muodostaa nopeasti tasapainon siihen, joten TLC: n aikana saatu tulos voi jossain määrin riippuen huoneen kosteudesta [6] .

Alumiinioksidi

Alumiinioksidi on polaarinen epäorgaaninen hydrofiilinen sorbentti. Se saadaan poistamalla termisesti vettä hydratoidusta alumiinihydroksidista . Kromatografiaa varten tarkoitettu alumiinioksidi kuumennetaan yleensä alhaiseen lämpötilaan, jolloin saadaan materiaali, jonka ominaispinta-ala on 50-250 m2/g. Sorboitu vesi poistetaan 250 °C:n lämpötilassa [7] .

Muokatut kiinteät vaiheet

Силикагель может быть модифицирован тремя типами реакций: этерификацией , взаимодействием с хлорсиланом, содержащим необходимый органический заместитель, или хлорированием с последующей обработкой литийорганическим соединением . Такая модификация приводит к образованию неподвижных фаз с особенными свойствами, которые зависят от природы заместителей и способа их присоединения к силикагелю [6] .

Yleisimmät ovat käänteiset faasit ( RP  ) , joissa piidioksoon tuotu substituentti on alkyyliketju , jonka pituus on 2-18 hiiliatomia. C2 -faasit ovat korvanneet kyllästettävän silikageelin tekniikat parafiinilla tai silikonöljyllä seuraavaa käytettäväksi käänteisen vaihekromatografian yhteydessä. Hydrofiiliset faasit sisältävät pinnalla aminohuryhmiä, dioliryhmiä, nitriiliryhmiä ja niitä voidaan käyttää sekä käänteisessä vaihe- että normaalissa faasikromatografiassa . Normaalivaihetilassa niillä on pienempi pitokyky ja ne eivät ole herkkiä kosteudelle. Tällaisilla faaseilla on usein erityinen selektiivisyys aminoryhmien emäksisyydestä tai hydroksyyliryhmien happamuudesta johtuen, mikä mahdollistaa analysoitavan seoksen komponenttien ulostulojärjestyksen muuttamisen [6] .

Selluloosa

Ensimmäinen selluloosan käyttötapa ohutkerroskromatografiassa oli paperikromatografia . Käytettävissä olevat levyt TLC: lle ja korkean suorituskyvyn TLC sallivat polaaristen aineiden seosten erottamisen, kun taas ainakin ternaariset veden seokset, orgaaninen liuotin, joka on sekoittumaton sen kanssa, ja vesiliukoinen liuotin, joka edistää yhden vaiheen muodostumista, käytetään eluentina [6] .

Liikkuva vaihe

Подвижная фаза отвечает за перемещение образца по хроматографической системе, и её правижльберния влопоправильберния выматографической системе. В качестве подвижной фазы ТСХ позволяет использовать как индивидуальный растворитель, так и сложные. При проведении хроматографии на силикагеле обычно используют смеси органических растворителей. В обращённо-фазовой хроматографии применяют смесь воды с органическим растворителем. В обоих случаях подвижная фаза может быть охарактеризована двумя параметрами: силой растворителя, определяющей степень подвижности компонентов образца по сорбенту, и селективностью, влияющей на порядок зон веществ. Минимальным требованием к подвижной фазе является по крайней мере частичная растворимость в ней образца.

Liuottimen vahvuus

Сила растворителя — это параметр, определяющий способность подвижной фазы перемещать вещества по сорбен Так, слабый растворитель не способен сдвинуть зону вещества с точки нанесения, а сильный, вачев9 напротив , смещ Подходящий элюент сдвигает вещество примерно на 1/3 от общего расстояния, преодолённого элюентом. В случае силикагеля более сильными являются полярные растворители, а более слабыми — неполярные (эта зависимость отличается для различных сорбентов) [10] .

Liuotinvoiman kvantitatiivinen kuvaus annetaan E ° -parametrilla , joka voidaan määritellä liuottimen adsorptioenergiaksi standardisorbentin yksikköyksikköä kohti. Käytännössä aineen läpi kulkevaa etäisyyttä ei voida laskea tämän parametrin perusteella, mutta suhteellinen arviointi on mahdollista: E ° : n suuremmalla arvolla aine kulkee suuremmalla tavalla ja päinvastoin. Käänteisillä vaiheilla tilanne on päinvastainen. Ainevyöhykkeen etäisyys liittyy myös sen napaisuuteen: enemmän polaarisia aineita on vuorovaikutuksessa enemmän silikageelin kanssa ja liikkuu hitaammin, kun taas ei -polaarinen vuorovaikutus ja siirtyy edelleen [10] .

Sopiva eluentti määritetään kokeellisesti. Näyte voidaan esimerkiksi kromatografoida etyyliasetaatissa .

Liuottimen laatu

Ohutkerroskromatografiassa käytettyjen liuottimien laadulla voi olla merkittävä rooli. Ainakin analyyttisen luokan liuottimia suositellaan, koska eluenttien sisältämät epäpuhtaudet voivat olla vuorovaikutuksessa sorbentin tai liuenneen aineen kanssa. Jotkut liuottimet hapettuvat itsestään varastoinnin aikana. Liuottimet voivat hajota tai muuten reagoida, kun niitä säilytetään metallisäiliöissä. Liuottimen vesipitoisuus vaikuttaa merkittävästi toistettavuuteen, jonka määrä voi muuttua ajan myötä, mikä johtaa eluentin voimakkuuden muutokseen. Esimerkiksi muiden epäpuhtauksien lisäksi kloroformi sisältää usein etanolia stabilointina, joista pienet määrät voivat vaikuttaa merkittävästi kromatografian tulokseen [10] .

Kokeilun suorittaminen

Näytteen valmistelu

Näytteen oikeaa valmistelua varten on valittava edustava osa materiaalista. Tämä vaatii yleensä sen täydellisen liuottamista sopivaan liuottimeen. Joskus ei ole mahdollista liuottaa koko näytettä: tässä tapauksessa on varmistettava, että ainakin tarvittavat aineet ovat liuenneet. Suuri määrä epäpuhtauksia tai matriisia aineessa voi heikentää analyysin tai erotuksen tuloksia, joten etukäteen voidaan soveltaa näytteen puhdistusvaihetta uuttomenetelmillä . Tämä vaihe toteutetaan käyttämällä levyjä, joissa on esiadsorptiokerros, joka vangitsee matriisin polaariset komponentit [11] .

Kolonnikromatografiaan verrattuna ohutkerroskromatografia on vähemmän vaativa epäpuhtauksille, koska kolonnit on pestävä ennen uusien näytteiden levittämistä ja TLC-levyjä käytetään vain kerran [11] .

Levyvalmistelu

Joskus levyille altistetaan lisävalmistusvaiheet ennen TLC: n suorittamista [12] .

• Levyjen esipesua käytetään niiden puhdistamiseen sorboituneista epäpuhtauksista, ja se suoritetaan yleensä upottamalla metanoliin tai eluoimalla tyhjä levy tässä elientissä (jälkimmäisessä tapauksessa pesun tehokkuus on suurempi).
• Aktivointi on suunniteltu poistamaan sitoutunut vesi sorbenttikerroksesta. Se suoritetaan kuumentamalla levyjä 30 minuuttia 120 °C:ssa (silikageelilevyille). Voimakkaampi ja pidempi kuumennus voi johtaa kemiallisesti sitoutuneen veden poistamiseen ja peruuttamattomaan muutokseen kromatografisen kerroksen ominaisuuksissa. Aktivoimattomiin levyihin verrattuna aktivoiduilla levyillä on paremmat pitoominaisuudet, aineiden liikkuvuus niillä hidastuu.
• Esikäsittely on aktivoidun tai aktivoimattoman levyn sijoittamista tietyn kosteuden tai kaasukoostumuksen omaavaan ilmakehään siten, että kromatografinen kerros imee tietyn määrän vettä tai muuta ilmakehän komponenttia (esimerkiksi eluenttihöyryjä). Tämä prosessi tapahtuu hallitsemattomasti eluointiastiassa, joka sisältää tarvittavan liuottimen, mutta on olemassa tekniikoita, jotka mahdollistavat suunnatun sorption levylle. Tätä varten käytetään esimerkiksi joidenkin suolojen kyllästettyjä liuoksia , joiden yläpuolella olevalla ilmakehällä on tietty kosteus.
• Lopuksi voi olla hyödyllistä kyllästää levyt orgaanisilla tai epäorgaanisilla aineilla kerroksen sorptioominaisuuksien muuttamiseksi. Se suoritetaan upottamalla, suihkuttamalla tai ennen eluottia kyllästettävällä liuoksella. Tyypillinen esimerkki kyllästetyn silikageelin käytöstä ohuessa kerroksen kromatografiassa on tyydyttymättömien orgaanisten aineiden analyysi piidionegelissa, joka sisältää hopea -ioneja .

Näytteen soveltaminen

Seoksen komponenttien erottuminen riippuu siis käytetyn vyöhykkeen koosta kromatografian suunnassa, ja näytteitä voi verrata niiden liikkuvuuden mukaan vain vyöhykkeiden paikannuksella tietueeseen. Kvantitatiivista analyysiä suoritettaessa on tarpeen soveltaa tarkasti mitattuja aineiden liuostilavuuksia [11] .

Näytteen käyttämiseen on kaksi tapaa: manuaalinen ja automaattinen. Manuaalisessa levityksessä levyyn merkitään lyijykynällä pisteet, jotka sijaitsevat levyn alareunan suuntaisella segmentillä ja sijaitsevat siitä sellaisella etäisyydellä, että pisteet eivät uppoa eluenttiin. Pisteiden lukumäärän tulee olla yhtä suuri kuin analysoitujen näytteiden lukumäärä. Sen jälkeen mikrokapillaareilla levitetään analysoitua näytteen liuosta merkittyihin kohtiin, jonka tilavuus on yleensä rajoitettu 5 μl:aan TLC:ssä ja 1 μl:aan korkean suorituskyvyn TLC:ssä. Suuria määriä liuoksia levitetään useilla kosketuksilla, jolloin liuotinlevy kuivataan niiden välissä. Tässä tapauksessa liuottimella, jossa näyte sijaitsee, tulee olla mahdollisimman vähän polaarisuutta, koska levityksen aikana tapahtuu ympyräkromatografiaa, joka voi johtaa näytteen komponenttien leviämiseen ja erottumiseen [11] .

Automaattiset ja puoliautomaattiset näytesovellusjärjestelmät käyttävät suihkeperiaatetta. Liuos vedetään ruiskun neulaan, neula sijoitetaan sitten tarkasti levyn pinnan yläpuolelle, ja mäntä puristaa tietyn liuoksen tilavuuden. Liuotin poistetaan puhaltamalla paineilmalla tai typellä. Teknologian avulla voit luoda kapeat ainevyöhykkeet, mikä myötävaikuttaa maksimaaliseen resoluutioon. Aineiden levitys on myös mahdollista pisteiden tai suorakaiteen muotoisten vyöhykkeiden muodossa, ja käytetyt tilavuudet voivat vaihdella muutamasta nanolitrasta korkean suorituskyvyn TLC: lle satoihin mikrolitreihin prepatiivista TLC: tä varten. Jälkimmäisessä tapauksessa tekniikka mahdollistaa tasaisen pitkänomaisen vyöhykkeen luomisen koko levyä pitkin [11] .

Elution

Kun tutkitun aineseoksen liuos on levitetty, levy asetetaan astiaan, jonka pohjalle kaadetaan kerros eluenttia. Kun levyn alareuna on upotettu nesteeseen, eluentti alkaa nousta kromatografista kerrosta ylöspäin kapillaarivoimien vaikutuksesta. Välttääkseen haihtuvan eluentin haihtumisen levyn pinnalta kromatografian aikana astia suljetaan. Kun etulinja on saavuttanut analyysia varten riittävän korkeuden, levy poistetaan ja kuivataan. Etulinjan kulkema matka lasketaan tavallisesti lähtöviivasta. Se valitaan riittäväksi erottuneiden aineiden myöhempää tunnistamista varten levyn pinnalla. Seoksen komponenttien erottuminen paranee tätä etäisyyttä kasvatuksella, mutta on olemassa optimaalinen arvo, joka perinteisillä levyillä on 12-15 cm. Tämä johtuu siitä, että kapillaarivoimat vaikuttavat kostutusrintaman linjoihin ja liikkuva faasi on vaikuttaa yhä vähemmän, kun se liikkuu kromatografisen kerroksen läpi.

Kromatografiaa suoritettaessa kestää 45 - 150 minuuttia etuosan etenemiseen optimaaliseen pituuteen riippuen eluentin viskositeetista. Korkean suorituskyvyn TLC:ssä kromatografisen kerroksen hiukkasten pakkaus on tiheämpi, optimaalinen etäisyys on noin 6 cm ja eluointi kestää 15-50 minuuttia [13] .

Существуют различные способы элюирования образцов на пластинках. Наиболее распространён способ с вертикальной пластинкой и поднимающимся элюентом: он даёт приемлельцатрезульёта Существуют также сосуды, позволяющие направлять подвижную фазу горизонтально. Результаты в этом случае сравнимы со стандартными, но преимущество в том, что подавать элюент можно одновременно в двух встречных направлениях, что позволяет удвоить число образцов (на высокопроизводительной пластине размером 20×10 см можно разделить одновременно 72 образца). Круговая и антикруговая хроматография, при которой движение элюента происходит от центра к периферии или наоборот, применяется весьма ограниченно, например, при подборе растворителя для хроматографии [13] .

Moninkertaista eliminointia käytetään, kun yksittäinen eliminointi ei mahdollista seoksen komponenttien tehokasta erottamista. Uudelleen eluoituessa samassa liuotinjärjestelmässä, optimointi tapahtuu väärin levitettyjen aineiden pitoisuuksien vuoksi. Voit myös esieliminoida lyhyen aikaa erittäin polaarisessa liuottimessa, jolloin aineet keskittyvät kerrokseen. Alustava eliminointi ei-polaarisessa liuottimessa mahdollistaa ei-polaarisen matriisin poistamisen kohteesta [13] .

Kaksiulotteinen eluointi sisältää kaksi peräkkäistä elimiä kohtisuoraan suuntaan. Ensimmäisen elaation jälkeen levy uutetaan, kuivataan, ja linjasta, jolla erotetut komponentit sijaitsevat, tulee lähtöviiva toisessa elue. Samanaikaisesti voit käyttää kahta eri voimaa, samoin kuin samaa vanhaa, mikä on hyödyllistä arvioitaessa aineen stabiilisuutta kromatografisessa kokeessa [13] .

Visualisointi

Eluoinnin jälkeen seoksesta erotetut aineet sijaitsevat levyn pinnalla tietyissä kohdissa. Niiden määräysten määrittämiseksi levylle ehdotetaan useita menetelmiä. Jos aine on maalattu, tahran sijainti määritetään visuaalisesti, lisäreagenssikäsittelyä tai visualisointia muilla menetelmillä ei tarvita. Useimmat orgaaniset yhdisteet ovat kuitenkin värittömiä. Jos aine imeytyy ultraviolettialueella, se visualisoidaan levylle fluoresoivalla indikaattorilla F 254 ultraviolettisäteilyn alaisena (tällaisten aineiden täplät levyllä näyttävät joko tummilta tai fluoresoivilta) [14] .

Enemmän tai vähemmän selektiivisiä kemiallisia kuvantamismenetelmiä käytetään laajalti. Yksinkertaisin tapa on esimerkiksi käsitellä jodihöyryllä , jolloin sorboidut aineet muuttuvat tummanruskeiksi ja tausta jää vaaleaksi. Universaalit menetelmät perustuvat erilaisten happojen tai hapettimien liuosten käyttöön , joiden kanssa aineet muodostavat kuumennettaessa ruskeita tai mustia pisteitä. Selektiiviset reagenssit, kuten ninhydriini , mahdollistavat tietyn luokan yhdisteiden visualisoinnin - amiinit ja aminohapot [14] .

Хроматографические тонкослойные пластинки также могут быть использованы в биологических тестах для выявления веществ с биологической активностью к микроорганизмам методом посева культур микроорганизмов в питательной среде на пластины [14] .

Tulosten arviointi

Näytteen ja tiettyjen standardien liikkuvuuden ja visualisoinnin luonteen (väri, fluoresenssi) visuaalinen vertailu antaa tietoa analysoitavan aineen luonteesta ja vyöhykkeen intensiteetti kuvaa sen määrää. Aineet voidaan myös pestä pois kromatografisesta kerroksesta jatkoanalyysiä varten muilla menetelmillä. Korkean suorituskyvyn TSH:n kvantitatiivinen arviointi suoritetaan digitaalikuvien perusteella standardoitujen menetelmien mukaisen kokeen jälkeen.

Ohutkerroskromatografian teoria

Liuotinvirtaus

Liikkuvan vaiheen virtaus kerroksen läpi ohuessa kerroksen kromatografiassa johtuu kapillaarivoimien vaikutuksesta. Nesteen etuosan liikkumista voidaan kuvata neliömäinen riippuvuus:

missä z f  on etäisyys uppoviivasta etulinjaan, t  on eluointiaika ja ϰ on virtausvakio eli nopeustekijä. Tämän suhteen perusti vuonna 1856 insinööri Henri Darcy , joka tutki maaperän veden tunkeutumisnopeutta huokoisen pinnan läpi. Yhtälö osoittaa, että etummainen vaellusnopeus pienenee hyperbolisesti vaellusreitin kasvaessa. Joten esimerkiksi annetulla arvolla ϰ = 3,3 cm²/s, etummainen siirtyminen 10 cm:llä kestää 30 minuuttia ja 15 cm:llä 68 minuuttia [16] . Virtausvakion ϰ määrää sorbenttihiukkasten halkaisija sekä eluentin pintajännityksen suhde sen viskositeettiin [17] . Kerrokseen sorboitunut vesi liittyy usein kerrokseen vahvemmin kuin eluumin komponentit. Tässä tapauksessa kerrokseen putoava vesi vähentää kerroksen huokoisuutta ja lisää eluumin nopeutta. Jos eluumin ja veden teho on vertailukelpoinen, niin eluentti syrjäyttää veden kerroksesta [18] .

Kaikki kromatografiset prosessit perustuvat aineen uudelleenjakautumiseen liikkuvan ja kiinteän faasin välillä. Tämä tasapaino liittyy lämpötilaan, ja sen noustessa aineen osuus liikkuvassa faasissa yleensä kasvaa. Tasapainon numeerista kuvaamista varten otetaan käyttöön uudelleenjakokertoimet:

где С s и С m  — концентрации вещества в сорбирующей и несорбирующей фазах, соответственно. Коэффициент перераспределения определяет угол наклона изотермы сорбции  — линейного графика завейного графика завейного графика . Интерес представляет случай искривлённой изотермы сорбции: в этом случае наклон кривой зависинцепой зависинцепнот. Для вогнутой изотермы сорбции (где K снижается при увеличении концентрации вещества) у пятна орбрацуетва». При выпуклой изотерме сорбции наблюдается противоположная ситуация: размывается передняя часть передняя часть ] т . Подобные эффекты объясняются кинетическими процессами (т. н. сопротивлением массопередаче) или нелинейным характером изотермы сорбции («перегрузкой»). В сложных смесях компоненты могут влиять друг на друга и создавать условия взаимной перегрузки. В этом случае К снижается [19] . Как правило, в аналитических приложениях нелинейность изотерм сорбции нежелательна нежелательна, поскольку онатри поскольку она приложениях изотерм сорбции нежелательна нежелательна Спрямление изотерм может быть достигнуто путём дезактивации сорбента. [В этом случае наиболее активные сорбционные центры занимаются дезактивирующими дезактивирующими ] .

Tavallinen ja yksinkertaisin parametri, joka kuvaa levyn aineen vyöhykkeen sijaintia, on retentiokerroin:

Missä Z X  on vyöhykkeen kulkema matka ja Z F  - Z 0  on etäisyys laukaisulinjasta liuottimen rintamaan. Tämä parametri on helppo mitata, mutta se ei sisällä tietoa kromatografisen prosessin olosuhteista. Tästä syystä tämän parametrin muut määritelmät R F ' aineen suhteelliseksi ajaksi liikkuvassa faasissa tai sorbaattimolekyylien osuukseksi liikkuvassa faasissa jne. [20] Retentiotekijän laskettu arvo on aina pienempi kuin yksikkö, joten käyttömukavuuden vuoksi otetaan käyttöön HR F -parametri , joka on aina Se ilmaistaan ​​kokonaisluvulla ja jota käytetään kvantitatiivisesti kuvaamaan vyöhykkeen sijaintia levyllä [21] :

Pääsääntöisesti aineen kulkema matka mitataan alkupisteestä ainevyöhykkeen keskelle . Tämä menetelmä soveltuu pienille vyöhykkeille, mutta lääkkeiden puhtausanalyyseissä, joissa aineen kuormitus saavuttaa 1000 μg pisteeseen asti, täplät usein lupaavat niin, että HR F -arvo vaihtelee alueella 18 yksiköitä. Lisäksi, jos tällaisen pisteen vieressä eliminoidaan näyte, jonka pitoisuus on paljon pienempi, tuloksena olevan pienen pisteen keskusta ei todennäköisesti täsmää varmasti mustelman vyöhykkeen keskustaan. Siksi HR F -arvo annetaan joskus intervallin muodossa, joka kattaa arvot vyöhykkeen alaosasta sen yläosaan [21] . Pohjimmiltaan erilainen parametri on RST:n arvo , joka lasketaan jakamalla kuljettu reitti jonkin vertailuaineen kulkemaan polkuun. Tällä hetkellä tämä parametri on käytännössä menettänyt arvonsa [21] .

Split options

Чтобы чётко описать степень разделения двух веществ, в тонкослойной хроматографии вводится параметр разрешающей способности R s , определяемой как частное от деления расстояния между центрами двух пятен z x2  — z x1 на ширину хроматографического пика:

Yhtälö osoittaa, että mitä suurempi on pisteiden keskipisteiden välinen etäisyys, sitä parempi erotus, mitä leveämmät täplät (vastaavasti mitä suurempi parametri σ on keski-sekvkraattinen poikkeama ), sitä huonommin aineet erottuvat. Kun R S = 0,5, pisteiden välinen etäisyys on σ 1 + σ 2 ≈ 2σ, eli tässä tapauksessa tapahtuu "jako 2σ" ja 20 % kahden vyöhykkeen pinta-alasta on tukossa. Kun jaettuna luvulla 4σ, vain 3 % alueesta on peitetty [22] .

Sovellus

Ohutkerroskromatografialla on kolme pääsovellusaluetta [23] .

1. Демонстрация основ хроматографии, быстрые предварительные эксперименты для оптимизации препаративнычерахративныхроматография
2. Исследовательские инструменты в академической и прикладной промышленной науке, используемые для изуческой используемые для изуческой; комбинация планарного разделения с биологической, спектроскопической и масс-спектрометрической детекцией).
3. Идентификация медицинских и пищевых растительных компонентов по валидированным методикам с повышенными требованиями к точности, воспроизводимости и чувствительности.

Muistiinpanot

1. ↑ Schoenbein Vrt. Verhl. Naturforsh. Ges. Basel, 3, 249 (1861)
2. viisitoista.
3. 17-20.
4. kaksikymmentä.
5. ↑ hahn-deinstrop, 2007 , s. yksi.
6. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ullmann, 2012 , s. 2-5.
7. ↑ Geiss, osa 1, 1988 , s. 375-377.
8. ↑ hahn-deinstrop, 2007 , s. 19.
9. ↑ Katso Eluration -osio
10. 5-7.
11. ↑ 1 2 3 4 5 Ullmann, 2012 , s. 7-9.
12. ↑ hahn-deinstrop, 2007 , s. 41-49.
13. 9-12.
14. ↑ 1 2 3 Ullmann, 2012 , s. 12-14.
15. ↑ ullmann, 2012 , s. 14-16.
16. 39-42.
17. ↑ Geiss, osa 1, 1988 , s. 45-52.
18. ↑ Geiss, osa 1, 1988 , s. 61.
19. ↑ 1 2 3 geiss, osa 1, 1988 , s. 146-151.
20. 152-153.
21. ↑ 1 2 3 hahn-deinstrop, 2007 , s. 4-6.
22. ↑ Geiss, osa 1, 1988 , s. 203-205.
23. ↑ Ullmann, 2012 , s. 2.

Kirjallisuus

Kirjat

• Heiss F. Ohutkerroskromatografian perusteet (tasokromatografia) = Fundamentals of Thin Layer Chromatography (Planar Chromatographi) / Per. englannista. M. A. Koshevnik ja B. N. Lapin, toim. V. G. Berezkin. - 1988. - T. 1.
• Heiss F. Ohutkerroskromatografian perusteet (tasokromatografia) = Fundamentals of Thin Layer Chromatography (Planar Chromatographi) / Per. englannista. M. A. Koshevnik ja B. N. Lapin, toim. V. G. Berezkin. - 1988. - T. 2.
• Kirchner Yu Ohutkerroskromatografia / Per. englannista. D. N. Sokolov ja M. I. Yanovsky, toim. -5000 kappaletta.
• Hahn-Deinstrop E. Applied Thin-Layer Chromatography. – 2. painos. -Wiley, 2007.- ISBN 978-3-527-31553-6 .
• Reich E., Widmer V. Ohutkerroskromatografia // Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. - Wiley, 2012. - doi : 10.1002/14356007.b05_301.pub2 .

Arvostelut

• Cheng S.-C., Huang M.-Z., Shiea J. Ohutkerroskromatografia/massaspektrometria  (englanniksi)  // Journal of Chromatography A. - 2011. - Voi. 1218, nro 19 . - P. 2700-2711. - DOI : 10.1016/J.chroma 2011.01.077 . — PMID 21334632 .
• Del Bubba M., Checchini L., Lepri L. Thin-Layer Chromatography Enantioseparations on Chiral Stationary Phasses: A Review  (englanniksi)  // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2013. - Vol. 405, nro 2-3 . - s. 533-554. -DOI : 10.1007/ S00216-012-6514-5 . — PMID 23161065 .
• Fuchs B., Süss R., Teuber K., Eibisch M., Schiller J. Lipid Analysis by Thin-Layer Chromatography - Review of the Current State   // Journal of Chromatography a.-Vol . 1218, nro 19 . - s. 2754-2774. - DOI : 10.1016/J.chroma 2010.11.066 . — PMID 21167493 .
• Morlock G., Schwack W. Tasomakromatografian kytkentä massaspektrometriaan  (englanniksi)  // TrAC Trends in Analytical Chemistry. - 2010. - Vol. 29, ei. 10 . - s. 1157-1171. - doi : 10.1016/j.trac.2010.07.010 .
• Poole CF Planar chromatography at the end of the century  (englanti)  // Journal of Chromatography A. - 1999. - Voi. 856, nro 1-2 . - s. 399-427. -DOI : 10.1016/ S0021-9673 (99) 00430-6 . — PMID 10526797 .
• Poole SK, Poole CF Korkean suorituskyvyn stationaarifaasit tasomakromatografiaan  (englanniksi)  // Journal of Chromatography A. - 2011. - Voi. 1218, nro 19 . - P. 2648-2660. - DOI : 10.1016/J.chroma 2010.10.072 .
• Rabel F., Sherma J. Stationary Phases for Modern Thin-Layer Chromatography  (englanniksi)  // LCGC North America. - 2012. - Vol. 30, ei. 6 . - s. 458-473.
• Renger B., Végh Z., Ferenczi-Fodor K. Ohutkerroskromatografisten ja korkean suorituskyvyn ohutkerroskromatografisten menetelmien validointi  (englanti)  // Journal of Chromatography a.-2011.-Vol. 1218, nro 19 . - P. 2712-2721. - DOI : 10.1016/J.chroma 2011.01.059 . — PMID 21329932 .
• Sherma J. Katsaus torjunta-aineiden ohutkerroskromatografiaan: 2010-2012  //  Journal of Environmental Science and Health, osa B: Torjunta-aineet, elintarvikesaasteet ja maatalousjätteet. - 2013. - Vol. 48, nro. 6 . - s. 417-430. - doi : 10.1080/03601234.2012.761526 . — PMID 23452207 .