Suljettu nukleiinihappo

Lukittu nukleiinihappo ( LNA), joka tunnetaan myös nimellä siltanukleiinihappo  (BNA) [1] ja jota usein kutsutaan saavuttamattomiksi RNA :ksi , on modifioitu RNA - nukleotidi , jossa riboosifragmenttia on modifioitu lisäsillalla, joka yhdistää 2'- happiryhmä. ja 4' hiili. Silta "lukitsee" riboosin 3'- endo- (pohjoiseen) konformaatioon, joka löytyy usein A-muodon duplekseista . Tämä rakenne lisää vastustuskykyä entsymaattista hajoamista vastaan ​​[2] [3] [4] [5] . LNA tarjoaa myös lisääntyneen spesifisyyden ja affiniteetin emäspariutumisen suhteen monomeerinä tai oligonukleotidin komponenttina [6] . LNA-nukleotidit voidaan sekoittaa oligonukleotidin DNA- tai RNA-tähteiden kanssa.

Synteesi

Obika ym. syntetisoivat ensimmäisenä LNA:n kemiallisesti vuonna 1997 [7] ja Jesper Wengelin ryhmä seurasi itsenäisesti vuonna 1998 [8] . Tämä tuli mahdolliseksi sen jälkeen, kun Zamechnik ja Stevenson vuonna 1978 loivat pohjan mahdollisuudelle, että oligonukleotidit voisivat olla erinomaisia ​​aineita geenin ilmentymisen säätelyssä [9] . Tähän mennessä on osoitettu, että kaksi erilaista lähestymistapaa, joita kutsutaan lineaariseksi ja konvergentiksi strategiaksi, tarjoavat korkean suorituskyvyn ja tehokkuuden LNA:ssa. Lineaarisen synteesistrategian kuvasivat ensin yksityiskohtaisesti Obick ym. [7] Tässä lähestymistavassa uridiinia (tai mitä tahansa saatavilla olevaa RNA - nukleosidiä ) voidaan käyttää lähtöaineena . Konvergenttistrategia edellyttää välituotesokerin synteesiä, joka toimii glykosyyliluovuttajana , välttämätön typpipitoisiin emäksiin sitoutumiseen . Tyypillisesti D-glukoosia käytetään välituotteen sokerin valmistukseen, joka saatetaan myöhemmin reagoimaan typpipitoisten emästen kanssa käyttämällä modifioitua Vorbrügen-menetelmää, joka mahdollistaa stereoselektiivisen sitoutumisen [10] .

Erilaisten fragmenttien lisääminen on edelleen mahdollista säilyttäen samalla keskeiset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, kuten korkea affiniteetti ja spesifisyys, jotka ovat ilmeisiä alun perin syntetisoidussa LNA:ssa [11] . Tällaiset oligomeerit syntetisoidaan kemiallisesti ja niitä on kaupallisesti saatavilla.

Sisällytys DNA:han/RNA:han

LNA voidaan liittää DNA:han ja RNA:han tiettyjen DNA- ja RNA-polymeraasien epävakaisuuden vuoksi. Phusion DNA -polymeraasi, kaupallisesti kehitetty Pfu DNA -polymeraasiin perustuva entsyymi , liittää tehokkaasti LNA:ta DNA:han [12] .

Ominaisuudet

LNA tarjoaa paremman biostabiilisuuden verrattuna biologisiin nukleiinihappoihin . LNA-modifioidut oligonukleotidit ovat osoittaneet parantunutta termodynamiikkaa hybridisoituneena RNA :han , yksijuosteiseen DNA:han ja kaksijuosteiseen DNA :han [13] .

Sovellus

LNA talvet

DNA- tsyymejä voidaan modifioida sisältämään LNA-tähteitä LNA-tsyymien (LNA-modifioitujen DNA-tsyymien) muodostamiseksi. Nämä modifioidut oligonukleotidit, kuten niiden sukulaiset DNA-tsyymit, ovat tyypillisesti endonukleaaseja , jotka sitoutuvat spesifisiin kohde-RNA-sekvensseihin ja katkaisevat fosfodiesterisidoksen , joka on olemassa nukleotidien välillä [14] . Niillä on kuitenkin tehokkaampi fosfodiesterisidoksen katkaisu verrattuna modifioimattomiin vastineisiin [15] . DNAzyme -substraatin tunnistuskäsivarsien modifiointi LNA- monomeereillä tuottaa LNAzymin, joka tunnistaa Coxsackievirus A21:n (CAV-21) ja katkaisee sen kohde- RNA -sekvenssin , samalla tavalla kuin ihmisen rinovirus −14:n (HRV- ) 5' -translatoitumattomalla alueella (5'UTR) . 14); sekvenssi, jota modifioimattomat DNA-tsyymit eivät tunnista [16] .

Terapia

LNA-pohjaisten oligonukleotidien terapeuttinen käyttö on biotekniikan uusi alue [17] . Eri LNA-oligonukleotidit arvioitiin niiden farmakokineettisten ja toksisuusprofiilien suhteen. Tutkimuksissa on päätelty, että LNA-toksisuus on yleensä riippumaton oligonukleotidisekvenssistä ja että sillä on edullinen turvallisuusprofiili translatoitavissa terapeuttisissa sovelluksissa [11] .

LNA:ta on tutkittu sen terapeuttisten ominaisuuksien vuoksi syövän ja tartuntatautien hoidossa. Estetty antisense-nukleiinihappofosforotioaattimolekyyli, nimeltään SPC2996, suunniteltiin kohdistamaan mRNA :ta , joka koodaa Bcl-2-onkoproteiinia, proteiinia, joka estää apoptoosia kroonisissa lymfaattisissa leukemiasoluissa (CLL). Vaiheen I ja II kliiniset tutkimukset osoittivat annoksesta riippuvan verenkierron CLL-solujen vähenemisen noin 30 %:ssa näytteestä, mikä viittaa SPC2996:n lisätutkimukseen [18] .

LNA:ta on sovellettu myös Miravirseniin , kokeelliseen hepatiitti C :n hoitoon , joka on 15 nukleotidin fosforotioaattisekvenssi, jolla on sitoutumisspesifisyys MiR-122 :lle ( hepatosyyteissä ilmentyvä miRNA ) [19] [20] .

Havaitseminen ja diagnoosi

LNA:ta käyttävä alleelispesifinen PCR mahdollistaa lyhyempien alukkeiden suunnittelun sitoutumisspesifisyydestä tinkimättä [21] .

LNA on sisällytetty fluoresoivaan in situ -hybridisaatioon (FISH) [22] . FISH on yleinen tekniikka, jota käytetään geneettisen materiaalin visualisoimiseen useissa soluissa, mutta tutkimukset ovat osoittaneet, että tätä tekniikkaa on rajoittanut koettimien huono hybridisaatiotehokkuus. Sitä vastoin LNA:han sisällytetyt koettimet ovat osoittaneet lisääntynyttä hybridisaatiotehokkuutta sekä DNA :ssa että RNA: ssa . FISH-suorituskyvyn parantaminen LNA-inkluusiolla on johtanut ihmisen kromosomien, useiden ei-ihmissolutyyppien ja mikrosirujen FISH-analyysiin [22] .

LNA-genotyyppimäärityksiä on myös suoritettu erityisesti apolipoproteiini B :n mutaatioiden havaitsemiseksi [23] .

Koska LNA pystyy erottamaan epäjohdonmukaisuudet, sen käyttöä on tutkittu diagnostisissa työkaluissa. Immobilisoituja LNA-koettimia on lisätty moninkertaisiin SNP-genotyypitysmäärityksiin [24] .

Geenien muokkaaminen

LNA-modifioituja ssODN:itä (synteettisiä yksijuosteisia DNA-oligonukleotideja) voidaan käyttää, kuten tavallisia ssODN:itä, yhden emäksen geenien muokkaamiseen. LNA:n käyttö aiotussa modifikaatiokohdassa tai sen lähellä välttää DNA:n epäsopivuuden korjaamisen, koska sillä on korkeampi termodynaaminen stabiilisuus [25] .

Viitteet

1. ↑ Elayadi, Anissa N. (elokuu 2002). Lukittujen nukleiinihappooligomeerien aiheuttaman korkean affiniteetin hybridisaation vaikutukset ihmisen telomeraasin estämiseen † . Biokemia _ _ ]. 41 (31): 9973-9981. DOI : 10.1021/bi025907j . ISSN  0006-2960 . PMID  12146961 .
2. ↑ Kurreck, J. (2002-05-01). "Lukituilla nukleiinihapoilla stabiloitujen antisense-oligonukleotidien suunnittelu". Nukleiinihappotutkimus . 30 (9): 1911-1918. DOI : 10.1093/nar/30.9.1911 . PMID  11972327 .
3. ↑ Frieden, M. (2003-11-01). "Antisense-oligonukleotidien suunnitteluhorisontin laajentaminen alfa-L-LNA:lla". Nukleiinihappotutkimus _ _ ]. 31 (21): 6365-6372. DOI : 10.1093/nar/gkg820 . ISSN  1362-4962 . PMID  14576324 .
4. ↑ Frieden, Miriam (lokakuu 2003). "LNA-oligonukleotidien ja LNA-DNA-kimeerojen nukleaasistabiilisuus" . Nukleosidit , nukleotidit ja nukleiinihapot ]. 22 (5-8): 1041-1043. DOI : 10.1081/NCN-120022731 . ISSN 1525-7770 . PMID 14565339 .  
5. ↑ Morita, K. (2001-11-01). "2'-O, 4'-C-Etyleen-sillatut nukleiinihapot (ENA), joilla on nukleaasiresistenssi ja korkea affiniteetti RNA:ta kohtaan". Nucleic Acids Symposium -sarja ]. 1 (1): 241-242. DOI : 10.1093/nass/1.1.241 . ISSN 0261-3166 . PMID 12836354 .  
6. ↑ Nukleiinihappojen lääketieteellinen kemia . - Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 2011. - 1 online-resurssi s. - ISBN 978-1-118-09280-4 , 1-118-09280-5 , 978-1-118-09283-5 , 1-118-09283-X 283-23990-5, 1-118-39 , 978-1-118-09281-1.
7. ↑ 1 2 Obika, Satoshi (1997-12-15). "2'-O,4'-C-metyleeniuridiinin ja -sytidiinin synteesi. Uudet bisykliset nukleosidit, joissa on kiinteä C3, -endo-sokerin rypistyminen” . Tetrahedron Letters [ englanti ] ]. 38 (50): 8735-8738. DOI : 10.1016/S0040-4039(97)10322-7 . ISSN  0040-4039 .
8. ↑ Orum, Miriam Frieden ja Henrik (31.3.2008). "Lukittu nukleiinihappo lupaa syövän hoidossa" . Nykyinen lääkesuunnittelu _ ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Haettu 2020-10-06 . 
9. ↑ Zamecnik, PC (1978-01-01). "Rousin sarkoomaviruksen replikaation ja solujen transformaation estäminen tietyllä oligodeoksinukleotidilla". Proceedings of the National Academy of Sciences ]. 75 (1): 280-284. Bibcode : 1978PNAS...75..280Z . DOI : 10.1073/pnas.75.1.280 . ISSN 0027-8424 . PMID 75545 .  
10. ↑ Koshkin, Aleksei A. (2001-12-01). "Yksinkertaistettu ja tehokas reitti 2'-O, 4'-C-metyleeniin kytkettyihin bisyklisiin ribonukleosideihin (lukittu nukleiinihappo)" . The Journal of Organic Chemistry . 66 (25): 8504-8512. doi : 10.1021/ jo010732p . ISSN 0022-3263 . PMID 11735531 .  
11. ↑ 1 2 Orum, Miriam Frieden ja Henrik (31.3.2008). "Lukittu nukleiinihappo lupaa syövän hoidossa" . Nykyinen lääkesuunnittelu _ ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Haettu 2020-10-06 . Orum, Miriam Frieden ja Henrik (31.3.2008). "Lukittu nukleiinihappo lupaa syövän hoidossa" . Nykyinen lääkesuunnittelu . 14 (11): 1138-1142. doi : 10.2174/138161208784246234 . PMID  18473860 . Haettu 2020-10-06 .
12. ↑ Veedu, Rakesh N. (26.3.2007). "LNA-nukleotidien entsymaattinen sisällyttäminen DNA-säikeisiin" . ChemBioChem [ englanti ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . 
13. ↑ Veedu, Rakesh N. (26.3.2007). "LNA-nukleotidien entsymaattinen sisällyttäminen DNA-säikeisiin" . ChemBioChem [ englanti ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . Veedu, Rakesh N.; Vester, Birte; Wengel, Jesper (26.3.2007). "LNA-nukleotidien entsymaattinen sisällyttäminen DNA-säikeisiin" . ChemBioChem . 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/cbic.200600501 . PMID  17315250 . S2CID  10206060 .
14. ↑ Breaker, R. R. (joulukuu 1994). "DNA-entsyymi, joka pilkkoo RNA:ta" . Kemia & Biologia . 1 (4): 223-229. DOI : 10.1016/1074-5521(94)90014-0 . ISSN  1074-5521 . PMID  9383394 .
15. ↑ Vester, Birte (marraskuu 2002). "LNAzymes: LNA-tyyppisten monomeerien sisällyttäminen DNA-tsyymeihin lisää merkittävästi RNA:n pilkkoutumista" . American Chemical Societyn lehti ]. 124 (46): 13682-13683. DOI : 10.1021/ja0276220 . ISSN  0002-7863 . PMID  12431091 .
16. ↑ Schubert, Steffen (toukokuu 2004). "Kohdepääsyn saaminen deoksiribotsyymeille." Journal of Molecular Biology ]. 339 (2): 355-363. DOI : 10.1016/j.jmb.2004.03.064 . PMID 15136038 . 
17. ↑ "LNA: monipuolinen työkalu terapiaan ja genomiikkaan". Biotekniikan trendit . 21 (2): 74-81. Helmikuu 2003. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
18. ↑ Dürig, J. (huhtikuu 2011). "Uusi antisense Bcl-2-estäjä SPC2996 aiheuttaa nopean leukeemisten solujen puhdistuman ja immuuniaktivaation kroonisessa lymfosyyttisessä leukemiassa." Leukemia [ englanti ] ]. 25 (4): 638-647. DOI : 10.1038/leu.2010.322 . ISSN  1476-5551 . PMID21358717  . _
19. ↑ Gebert, Luca F.R. (2014-01-01). "Miravirsen (SPC3649) voi estää miR-122:n biogeneesiä." Nukleiinihappotutkimus . 42 (1): 609-621. doi : 10.1093/nar/ gkt852 . ISSN 0305-1048 . PMID24068553 . _  
20. ↑ Bonneau, E. (24.6.2019). "Kuinka lähellä miRNA:t ovat kliinisestä käytännöstä? Näkökulma diagnostisiin ja terapeuttisiin markkinoihin”. EJIFCC . 30 (2): 114-127. ISSN  1650-3414 . PMID  31263388 .
21. ↑ Bonetta L (2005). "Reaaliaikaisen PCR:n ensisijainen aika". Nat. Menetelmät . 2 (4): 305-312. DOI : 10.1038/nmeth0405-305 .
22. ↑ 1 2 Kubota, Kengo (elokuu 2006). "Parannettu in situ -hybridisaatiotehokkuus lukituilla nukleiinihappoihin sisällytetyillä DNA-koettimilla". Soveltava ja ympäristömikrobiologia . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .
23. ↑ Kubota, Kengo (elokuu 2006). "Parannettu in situ -hybridisaatiotehokkuus lukituilla nukleiinihappoihin sisällytetyillä DNA-koettimilla". Soveltava ja ympäristömikrobiologia . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .Kubota, Kengo; Ohashi, Akiyoshi; Imachi, Hiroyuki; Harada, Hideki (elokuu 2006). "Parannettu in situ -hybridisaatiotehokkuus lukituilla nukleiinihappoihin sisällytetyillä DNA-koettimilla" . Soveltava ja ympäristömikrobiologia . 72 (8): 5311-5317. doi : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMC  1538721 . PMID  16885281 .
24. ↑ "LNA: monipuolinen työkalu terapiaan ja genomiikkaan". Biotekniikan trendit . 21 (2): 74-81. Helmikuu 2003. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .Petersen M, Wengel J (helmikuu 2003). "LNA: monipuolinen työkalu terapiaan ja genomiikkaan". Biotekniikan trendit . 21 (2):74-81. doi : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
25. ↑ van Ravesteyn, TW (12. huhtikuuta 2016). "Yksijuosteisten DNA-oligonukleotidien LNA-modifikaatio mahdollistaa hienovaraisen geenimuuntelun epäsopivuuden korjaamiseen taitavissa soluissa." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United of America . 113 (15): 4122-7. DOI : 10.1073/pnas.1513315113 . PMID  26951689 .