Tyypin III eritysjärjestelmät

Tyypin III eritysjärjestelmät ( eng.  Type III eritysjärjestelmä , lyhenne T3SS ), myös tyypin III eritysjärjestelmä tai injektosomi (ns. molekyyliruisku ) - yksi useista bakteerien eritysjärjestelmistä , on proteiinikompleksi (jota joskus pidetään nimellä organelli ), jota esiintyy joissakin gramnegatiivisissa bakteereissa [1] .

Patogeenisissa bakteereissa neulamaista rakennetta käytetään sensorisena koettimena havaitsemaan eukaryoottisten organismien solujen läsnäolo ja vapauttamaan proteiineja , jotka auttavat bakteereja tarttumaan ne. Eritetyt efektoriproteiinit kulkevat suoraan bakteerisolusta eukaryoottisoluun (isäntäsoluun) [2] , missä niillä on useita vaikutuksia, jotka auttavat patogeeniä selviytymään ja välttämään immuunivasteen .

Yleiskatsaus

Termi tyypin III eritysjärjestelmä otettiin käyttöön vuonna 1993 [3] . Tämä eritysjärjestelmä eroaa vähintään viidestä muusta gramnegatiivisista bakteereista löytyvästä eritysjärjestelmästä. Monilla eläimiin ja kasveihin liittyvillä bakteereilla on samanlaiset T3SS:t. T3SS-tiedot ovat samanlaisia ​​​​erilaisen evoluution seurauksena, ja fylogeneettiset analyysit tukevat mallia, jossa gramnegatiiviset bakteerit voivat välittää liikkuvan T3SS-geenikasetin horisontaalisesti muille lajeille. Tutkituimmat T3SS-lajit ovat Shigella (aiheuttaa basillaarista punatautia ), Salmonella ( lavantauti ), Escherichia coli ( suoliston mikrofloora , jotkut kannat aiheuttavat ruokamyrkytystä ), Vibrio ( vatsatulehdus ja ripuli ), Burkholderia ( mehut ), Yersinia ( rutto ) . , Chlamydia ( klamydia , sukupuolitaudit ), Pseudomonas (tarttuu ihmisiin, eläimiin ja kasveihin) ja kasvipatogeenit Erwinia , Ralstonia ja Xanthomonas sekä kasvisymbiontti Rhizobium .

T3SS koostuu noin 30 eri proteiinista, mikä tekee siitä yhden monimutkaisimmista eritysjärjestelmistä. Sen rakenne on samanlainen kuin bakteerisiima (pitkät, jäykät, solunulkoiset rakenteet, joita käytetään liikkumiseen). Jotkut T3SS:ään osallistuvista proteiineista jakavat aminohapposekvenssihomologian flagellaaristen proteiinien kanssa. Joillakin bakteereilla, joilla on T3SS, on myös siimoja ja ne ovat liikkuvia (kuten Salmonella ), kun taas joillakin ei (kuten Shigella ). Teknisesti ottaen tyypin III eritysjärjestelmää käytetään sekä infektioon liittyvien proteiinien että flagellaaristen komponenttien puhdistamiseen. Termiä "tyypin III eritysjärjestelmä" käytetään kuitenkin pääasiassa infektiolaitteiston yhteydessä. Bakteerisiimalla on yhteinen esi-isä tämän eritysjärjestelmän kanssa [4] [5] .

T3SS:t ovat välttämättömiä monien patogeenisten bakteerien patogeenisuudelle (tartunnakyvylle). T3SS:n viat voivat tehdä tällaisista bakteereista ei-patogeenisiä. On ehdotettu, että jotkin Gram-negatiivisten bakteerien ei-invasiiviset kannat menettivät T3SS:n, koska tällaista energeettisesti haitallista (kallista) järjestelmää ei käytetty [6] . Vaikka perinteiset antibiootit ovat olleet tehokkaita näitä bakteereja vastaan ​​aiemmin, uusia antibiooteille vastustuskykyisiä kantoja ilmaantuu jatkuvasti. T3SS:n toiminnan ymmärtäminen ja lääkkeiden kehittäminen erityisesti tätä järjestelmää varten on ollut monien tutkimusryhmien tärkeä tavoite ympäri maailmaa 1990-luvun lopulta lähtien.

Rakenne

T3SS:n erottuva piirre on ns. neula [7] [8] (yleisemmin Needle complex , lyhenne NC ) tai T3SS - laite ( eng  . T3SS apparatus , lyhenne T3SA ), jota kutsutaan myös injektosomiksi , kun ATPaasi on inaktiivinen . ((off); katso alla. Eritettävät bakteeriproteiinit kulkeutuvat bakteerin sytoplasmasta neulan kautta suoraan isäntäsolun sytoplasmaan . Kolme kalvoa erottaa kaksi sytoplasmaa: Gram-negatiivisten kaksoiskalvo (sisä- ja ulkokalvot) bakteerit ja eukaryootti Neula mahdollistaa sujuvan kulkemisen näiden erittäin selektiivisten ja lähes läpäisemättömien kalvojen läpi.Yhdessä bakteerissa voi olla useita satoja neulakomplekseja jakautuneena sen kalvopinnoille. On ehdotettu, että neulakompleksi on kaikkien T3SS-patogeenisten bakteerien yleinen ominaisuus [ 9] .  

Neulakompleksin alku sijaitsee bakteerin sytoplasmassa, se ylittää kaksi kalvoa ja työntyy ulos solusta. Kalvossa sijaitsevan kompleksin ankkuri on T3SS: n kanta (tai perusrunko ). Solunulkoinen osa on neula. Ns. sisätanko yhdistää neulan alustaan. Itse neula, vaikka se on T3SS:n suurin ja näkyvin osa, koostuu useista yhden proteiinin yksiköistä. Siksi useimmat erilaisista T3SS-proteiineista ovat niitä, jotka ovat osa emästä, ja niitä, jotka erittyvät isäntäsoluun. Kuten edellä mainittiin, neulakompleksi on samanlainen kuin bakteerisiima . Tarkemmin sanottuna neulakompleksin kanta on rakenteellisesti hyvin samanlainen kuin flagellan emäkset; Itse neula on analoginen flagellarikoukun kanssa, rakenne, joka yhdistää kannan flagellarifilamenttiin [10] [11] .

Pohja koostuu useista pyöreistä renkaista ja on ensimmäinen rakenne, joka on rakennettu uuteen neulakkokompleksiin. Kun pohjan rakentaminen on valmis, se toimii molekyylikoneena ulkoisten proteiinien eritykseen (eli neula). Kun koko kompleksi on valmis, järjestelmä siirtyy erittämään proteiineja, jotka on tarkoitettu toimitettavaksi isäntäsoluihin. Oletetaan, että neula on rakennettu alhaalta ylöspäin; neulan proteiinimonomeerien yksiköt pinoavat päällekkäin niin, että neulan kärjessä oleva yksikkö lisätään viimeisenä. Neula-alayksikkö on yksi pienimmistä T3SS-proteiineista, mitattuna noin 9 kDa. Neula koostuu 100-150 alayksiköstä.

T3SS-neula on noin 60–80 nm pitkä ja 8 nm leveä ulkoosasta. Neulan tulee olla mahdollisimman lyhyt, jotta muut solunulkoiset bakteerirakenteet (esim. adhesiinit ja lipopolysakkaridikerros ) eivät häiritse eritystä. Neulanreiän halkaisija on 3 nm. Suurin osa laskostuneista efektoriproteiineista on liian suuria kuljetettavaksi neulan aukon läpi, joten useimpien erittyneiden proteiinien on läpäistävä laskostumattoman neulan läpi, minkä suorittaa rakenteen pohjassa sijaitseva ATPaasi [12] .

T3SS-proteiinit

T3SS-proteiinit voidaan ryhmitellä kolmeen luokkaan:

• Rakenneproteiinit: tuottavat pohjan, sisäytimen ja neulan.
• Effektoriproteiinit: erittyvät isäntäsoluun ja edistävät infektiota / heikentävät isäntäsolun puolustusta.
• Chaperonit : sitovat efektoreita bakteerien sytoplasmassa, suojaavat niitä aggregaatiolta ja hajoamiselta ja ohjaavat ne edelleen neulakompleksiin.

Useimmat T3SS-geenit sijaitsevat operoneissa . Nämä operonit sijaitsevat joissakin bakteerilajeissa nukleoideissa ja muissa lajeissa eristetyissä plasmideissa . Esimerkiksi salmonellalla on kromosomialue, jolle suurin osa T3SS-geeneistä on koottu, niin kutsuttu Salmonellan patogeniteettisaari ( englanniksi Salmonella patogenicity island , lyhenne SPI ). Toisaalta Shigellalla on suuri virulentti plasmidi, joka sisältää kaikki T3SS-geenit. Monet patogeenisuussaarekkeet ja plasmidit sisältävät elementtejä, jotka mahdollistavat saarekkeen tai plasmidigeenin toistuvan horisontaalisen siirron uuteen lajiin.  

Järjestelmän on tunnistettava neulan kautta eritettävät efektoriproteiinit, kun ne kelluvat sytoplasmassa tuhansien muiden proteiinien mukana. Tunnistuksen suorittaa erityssignaali - lyhyt aminohapposekvenssi, joka sijaitsee proteiinin alussa (N-päässä) (yleensä se sisältää 20 ensimmäistä aminohappoa), jonka neulakompleksi pystyy tunnistamaan. Toisin kuin muut eritysjärjestelmät, T3SS-proteiinien erityssignaali ei koskaan katkea proteiinista.

Erityksen induktio

Neulan kosketus isäntäsoluun laukaisee T3SS-aktivoinnin [13] ; tästä laukaisumekanismista tiedetään vähän (katso alla). Erittämistä voidaan indusoida myös vähentämällä kalsiumionien konsentraatiota viljelyalustassa ( Yersinia ja Pseudomonas ; lisätään kelaattoreita , kuten EDTA tai EGTA) ja lisäämällä viljelyalustaan ​​aromaattista väriainetta Congo red (esimerkiksi Shigellalle ). Näitä ja muita menetelmiä käytetään laboratorioissa tyypin III eritysjärjestelmän keinotekoiseen stimulointiin.

Erittymisen indusoiminen muilla ulkoisilla signaaleilla kuin kontaktilla isäntäsolujen kanssa tapahtuu myös in vivo infektoiduissa organismeissa. Bakteerit tunnistavat vihjeitä, kuten lämpötilan , pH :n , osmolaarisuuden ja happipitoisuuden, ja käyttävät niitä "päättäessään", aktivoivatko ne T3SS:ään vai ei. Esimerkiksi salmonella voi paremmin lisääntyä ja päästä sykkyräsuoleen kuin eläimen umpisuoleen . Bakteerit voivat tietää missä ne ovat näillä alueilla olevien eri ionien ansiosta. sykkyräsuoli sisältää formiaatti- ja asetaattianioneja, kun taas umpisuole ei. Bakteerit tunnistavat nämä molekyylit, määrittävät niiden olevan sykkyräsuolessa ja aktivoivat eritysmekanisminsa. Umpisuolessa olevat molekyylit, kuten propionaatti ja butyraatti, vaikuttavat negatiivisesti bakteereihin ja estävät erittymistä. Kolesteroli , jota löytyy useimmista eukaryoottisolukalvoista, pystyy indusoimaan eritystä Shigellassa.

Yllä luetellut ulkoiset signaalit säätelevät eritystä suoraan tai geneettisen mekanismin kautta. Useiden transkriptiotekijöiden tiedetään säätelevän T3SS-geenien ilmentymistä. Jotkut T3SS-efektoreita sitovista chaperoneista toimivat myös transkriptiotekijöinä. On ehdotettu palautemekanismia: kun bakteeri ei eritä, sen efektoriproteiinit sitoutuvat chaperoneihin ja kelluvat sytoplasmassa. Kun eritys alkaa, chaperonit erotetaan efektoreista ja jälkimmäiset erittyvät ja poistuvat solusta. Yksinäiset chaperonit toimivat sitten transkriptiotekijöinä sitoutumalla niiden efektoreita koodaaviin geeneihin ja indusoimalla niiden transkriptiota ja siten tuottamalla lisää efektoreita.

3SS-tyyppisiä injektosomeja muistuttavia rakenteita on ehdotettu in vivo bakteerien gramnegatiivisten ulko- ja sisäkalvojen niiteiksi, jotka auttavat vapauttamaan ulkokalvorakkuloita, jotka on suunnattu kuljettamaan bakteerieritteitä eukaryoottisiin isäntäsoluihin tai muihin kohdesoluihin [14] .

T3SS-välitteinen infektio

T3SS-efektorit tulevat neulakompleksiin tyvestä ja kulkevat neulan läpi isäntäsoluun. Tarkkaa tapaa, jolla efektorit saapuvat isäntäsoluun, ymmärretään huonosti. Aikaisemmin on ehdotettu, että neula itse pystyy lävistämään reiän isäntäsolukalvoon; tämä teoria on kumottu. Nyt on selvää, että jotkin efektorit, niin sanotut translokaattorit , erittyvät ensin ja tuottavat isäntäsolun kalvoon huokosen tai kanavan ( translokon ), jonka kautta muut efektorit voivat päästä sisään. Mutatoidut bakteerit, joista puuttuu translokaattorit, pystyvät erittämään proteiineja, mutta eivät pysty toimittamaan niitä isäntäsoluihin. Yleensä jokainen T3SS sisältää kolme translokaattoria. Joillakin translokaattoreilla on kaksoisrooli; osallistuttuaan huokosten muodostumiseen ne siirtyvät soluun ja toimivat todellisina efektoreina.

T3SS-efektorit manipuloivat isäntäsoluja useilla tavoilla. Silmiinpistävin vaikutus on isäntäsolun bakteerin sisäänoton stimulaatio. Monien T3SS:n omaavien bakteerien on päästävä isäntäsoluihin lisääntyäkseen ja lisääntyäkseen. Effektorit, jotka ne tuovat isäntäsoluun, saavat isännän nielaisemaan bakteerin ja käytännössä "syömään" sen. Tämän saavuttamiseksi bakteeriefektorit manipuloivat isäntäsolun aktiinin polymerointimekanismia. Aktiini on sytoskeleton komponentti ja osallistuu myös solujen liikkuvuuteen ja muodon muutoksiin. T3SS-efektoriensa kautta bakteeri pystyy käyttämään isäntäsolun omaa koneistoa omaksi hyödykseen. Kun bakteeri on päässyt soluun, se pystyy helpommin erittämään muita efektoreita ja pääsemään naapurisoluihin, jolloin koko kudos tarttuu nopeasti.

T3SS-efektorien on myös osoitettu vaikuttavan isäntäsolun kiertoon ja jotkin niistä kykenevät indusoimaan apoptoosia . Yksi tutkituimmista T3SS - efektoreista on Shigella flexnerin IpaB . Sillä on kaksoisrooli, sekä translokaattorina, joka luo huokosia isäntäsolukalvoon, että efektorina, jolla on monia negatiivisia vaikutuksia isäntäsoluun. On osoitettu, että IpaB indusoi apoptoosia makrofageissa , eläimen immuunijärjestelmän soluissa, sen jälkeen kun ne ovat ottaneet sen vastaan ​​[15] . Myöhemmin IpaB:n osoitettiin saavuttavan tämän olemalla vuorovaikutuksessa kaspaasi 1 :n kanssa , joka on tärkeä säätelyproteiini eukaryoottisoluissa [16] .

Toinen hyvin karakterisoitu T3SS-efektorien luokka ovat transkriptioaktivaattorin kaltaiset aktivaattorit (TAL-efektorit) Xanthomonasissa . Kun nämä proteiinit viedään kasvisoluihin, ne voivat päästä kasvisolun tumaan, sitoa promoottorisekvenssejä ja aktivoida kasvigeenien transkription, jotka auttavat bakteeri-infektiossa [17] . Äskettäin on osoitettu, että TAL-efektori-DNA:n tunnistus sisältää yksinkertaisen koodin [18] [19] , joka on parantanut huomattavasti ymmärrystä siitä, kuinka nämä proteiinit voivat muuttaa geenin transkriptiota isäntäkasvisoluissa.

Ratkaisemattomat ongelmat

1990-luvun puolivälistä lähtien T3SS:stä on julkaistu satoja artikkeleita. Lukuisia järjestelmää koskevia ongelmia on kuitenkin edelleen ratkaisematta:

• T3SS proteiinit. Noin 30 T3SS-proteiinista alle 10 jokaisessa organismissa on havaittu suoraan biokemiallisin menetelmin. Loput, ehkä harvinaiset, ovat osoittautuneet vaikeiksi havaita ja pysyvät teoreettisina (vaikka geneettisiä kuin biokemiallisia tutkimuksia on tehty monille T3SS-geeneille/proteiineille). Kunkin proteiinin sijaintia ei myöskään tunneta hyvin.
• Neulan pituus. Ei tiedetä, miten bakteeri "tietää", kun uusi neula on saavuttanut oikean pituuden. On olemassa useita teorioita, mukaan lukien "lineaarisen proteiinin" olemassaolo, joka jollakin tavalla yhdistää neulan kärjen ja pohjan. Uusien monomeerien lisäämisen neulan kärkeen pitäisi venyttää lineaarista proteiinia ja siten ilmoittaa neulan pituudesta kantaan.
• Prosessin energia. Voimaa, joka ohjaa proteiinien kulkua neulan sisällä, ei täysin tunneta. ATPaasi, joka liittyy T3SS:n emäkseen ja osallistuu proteiinien suuntaan neulan kautta; mutta ei ole selvää, toimittaako se energiaa translokaatioon.
• erityssignaali. Kuten edellä mainittiin, erityssignaalin olemassaolo efektoriproteiineissa tunnetaan. Tämän signaalin avulla järjestelmä pystyy erottamaan T3SS:n kuljettamat proteiinit mistä tahansa muusta proteiineista. Sen luonne, vaatimukset ja tunnistusmekanismi ovat huonosti ymmärrettyjä, mutta äskettäin on kehitetty menetelmiä ennustamaan, mitä bakteeriproteiineja tyypin III eritysjärjestelmä voi kuljettaa [21] .
• erityksen aktivointi. Bakteerin on tiedettävä, milloin on aika vapauttaa efektoreita. Jätteen erittyminen, kun isäntäsolua ei ole lähellä, on bakteerille hukkaa energiaa ja resursseja. Bakteeri pystyy jotenkin tunnistamaan neulan kosketuksen isäntäsoluun. Kuinka tämä tehdään, tutkitaan edelleen, ja menetelmä saattaa hyvinkin riippua taudinaiheuttajasta. Jotkut teoriat olettavat herkkää konformaatiomuutosta neulan rakenteessa joutuessaan kosketuksiin isäntäsolun kanssa; tämä muutos toimii luultavasti signaalina emäkselle aloittaa erityksen. Salmonellasta on löydetty yksi tunnistusmenetelmä, joka perustuu isäntäsolun sytosolisen pH:n mittaamiseen patogeenisyyssaarekkeen 2 koodaaman T3SS:n kautta efektorien erittymisen laukaisemiseksi [22] .
• Ohjaajien sitominen. Ei tiedetä, milloin chaperonit sitovat efektorinsa (translation aikana tai sen jälkeen) ja miten ne erottuvat efektoreistaan ​​ennen erittymistä.
• efektorimekanismit. Vaikka 2000-luvun alun jälkeen on löydetty paljon tietoa siitä, kuinka T3SS-efektorit manipuloivat isäntäsolua, suurin osa vaikutuksista ja reiteistä jää tuntemattomiksi.
• Evoluutio. Kuten jo mainittiin, T3SS on läheistä sukua bakteerisiimalle [23] . Kilpailevia hypoteesia on kolme [24] : ensinnäkin, että siima kehittyi ensin ja T3SS johdettiin tästä rakenteesta, toiseksi, että T3SS kehittyi ensin ja siima johdettiin siitä, ja kolmanneksi, että nämä kaksi rakennetta muodostuivat yhteisestä esi-isästä. [25] . Eri skenaarioista on kiistelty [4] [24] , koska ne kaikki selittävät proteiinien homologian kahden rakenteen välillä sekä niiden toiminnallisen monimuotoisuuden. Viimeaikaiset fylogenomiset todisteet kuitenkin tukevat hypoteesia, jonka mukaan T3SS on peräisin siimosta prosessilla, joka sisältää aluksi geenin menetyksen ja sitten geenin hankinnan [26] . Avainvaihe jälkimmäisessä prosessissa oli sekretiinien värvääminen T3SS:ään, tapahtuma, joka tapahtui vähintään kolme kertaa muista kalvoon sitoutuneista järjestelmistä.

T3SS-proteiinin nimikkeistö

1990-luvun alusta lähtien uusia T3SS-proteiineja on löydetty eri bakteerilajeista tasaisella nopeudella. Lyhenteet on annettu erikseen jokaiselle proteiinisarjalle kussakin organismissa, eivätkä nimet yleensä paljasta monia proteiinin toimintoja. Myöhemmin osoitettiin, että jotkin eri bakteereista itsenäisesti löydetyt proteiinit ovat homologisia; historialliset nimet ovat kuitenkin suurelta osin säilyneet, mikä voi johtaa sekaannukseen. Esimerkiksi proteiinit SicA, IpgC ja SycD ovat homologeja Salmonellasta , Shigellasta ja Yersiniasta , mutta niiden nimen viimeinen kirjain ("sarjanumero") ei osoita tätä ilmiötä.

Seuraavassa on yhteenveto useiden T3SS:ää sisältävien lajien yleisimmistä proteiinisarjanimistä. Huomaa, että nämä nimet sisältävät proteiineja, jotka muodostavat T3SS-mekanismin, sekä erittyvät efektoriproteiinit:

• Yersinia
  • Yop : Yersinia ulkoproteiini
  • Ysc : Yersinia- eritys (komponentti)
  • Ypk : Yersinia -proteiinikinaasi
• Salmonella
  • Spa : Antigeenin pintaesitys
  • Sic : Salmonella -invaasion chaperone
  • Sip : Salmonellan hyökkäysproteiini
  • Prg : PhoP-repressoitu geeni
  • Inv : Invaasio (hyökkäys, infektio)
  • Org : Hapen säätelemä geeni
  • Ssp : Salmonellan erittämä proteiini
  • Iag : Invaasioon liittyvä geeni
• Shigella
  • Ipg : Invasioplasmidigeeni
  • Ipa : Invasioplasmidiantigeeni
  • Mxi : Ipa:n kalvoekspressio
  • Spa : Antigeenin pintaesitys
  • Osp : Ulkoinen Shigella- proteiini
• Escherichia
  • Tir : Siirtynyt intiminireseptori
  • Syyskuu : E. coli -proteiinien eritys
  • Esc : Escherichia- eritys (komponentti)
  • Esp : Escherichian eritysproteiini
  • Ces : E. colin erityksen valvoja
• Pseudomonas
  • Hrp : Yliherkkä vaste ja patogeenisyys
  • Hrc : Yliherkkä vaste säilynyt (tai Hrp säilynyt)
• Rhizobium
  • Nop : Nodulaatioproteiini
  • Rhc : Rhizobium säilötty
• Joissakin muissa tyypeissä
  • Vir : Virulenssi (virulenssi)

Näitä lyhenteitä seuraa kirjain tai numero. Kirjaimet tarkoittavat yleensä "sarjanumeroa", joko kronologista löytöjärjestystä tai fyysistä järjestystä, jossa geeni esiintyi operonissa. Numerot osoittavat harvinaisemmissa tapauksissa proteiinin molekyylipainon kDa:na. Esimerkkejä: IpaA, IpaB, IpaC; MxiH, MxiG, MxiM; Spa9, Spa47.

Useita avainelementtejä esiintyy kaikissa T3SS:issä: neulan monomeeri, neulan sisävarsi, pyöreät proteiinit, kaksi translokaattoria, neulan kärjen proteiini, lineaarinen proteiini (jonka uskotaan määrittävän neulan pituuden; katso edellä) ja ATPaasi, joka toimittaa energiaa erittymiseen. Seuraavassa taulukossa luetellaan joitain näistä tärkeimmistä proteiineista neljässä T3SS:ää sisältävässä bakteerissa:

T3SS-tutkimuksessa käytetyt menetelmät

T3SS-neulakompleksien eristäminen

Suurten, hauraiden, hydrofobisten kalvorakenteiden eristäminen soluista on ollut ongelma useiden vuosien ajan. 1990-luvun loppuun mennessä oli kuitenkin kehitetty useita lähestymistapoja T3SS-neulamaisten kompleksien (NC) eristämiseksi. Vuonna 1998 ensimmäiset NC:t eristettiin Salmonella typhimuriumista [27] .

Eristettyjä bakteereja kasvatetaan suuressa tilavuudessa nestemäistä kasvualustaa, kunnes ne saavuttavat log-vaiheen. Sitten ne sentrifugoidaan; supernatantti (elatusaine) dekantoidaan ja pelletti (bakteerit) suspendoidaan uudelleen lyysipuskuriin, joka sisältää tavallisesti lysotsyymiä ja joskus detergenttejä , kuten LDAO tai Triton X-100 . Tällainen puskuri tuhoaa soluseinän . Useiden lyysi- ja pesusyklien jälkeen paljastetut bakteerit altistetaan sarjalle ultrasentrifugaatioita . Tämä lähestymistapa lisää suurten makromolekyylirakenteiden määrää ja hylkää pienet solukomponentit. Lisäksi lopullinen lysaatti puhdistetaan edelleen käyttämällä CsCl-tiheysgradienttia.

Lisäpuhdistusmenetelmänä käytetään affiniteettikromatografiaa . Rekombinantti-T3SS-proteiinit, joissa on proteiinimerkki (esim. histidiinimerkki ), saadaan molekyylikloonauksella ja sitten viedään (transformoidaan) kiinnostaviin bakteereihin. NC:n alkuperäisen eristämisen jälkeen edellä kuvatulla tavalla lysaatti johdetaan kolonnin läpi, joka on päällystetty hiukkasilla, joilla on suuri affiniteetti leimaa kohtaan (histidiinileimojen tapauksessa: nikkeli-ionit). Leimattu proteiini varastoidaan kolonniin ja sen mukana koko neulakompleksi. Tällaisia ​​menetelmiä käyttämällä voidaan saavuttaa korkeat puhtausasteet. Tämä puhtaus on välttämätön monille herkille analyyseille, joita on käytetty NC:n karakterisoimiseen.

Tyypin III efektorit ovat olleet tiedossa 1990-luvun alusta lähtien, mutta kuinka ne toimitetaan isäntäsoluihin, on ollut täydellinen mysteeri. Monien flagellaaristen proteiinien ja T3SS-proteiinien välinen homologia sai tutkijat epäilemään T3SS:n ulkoisen flagellamaisen rakenteen olemassaoloa. Neulan rakenteen tunnistaminen ja myöhempi eristäminen mahdollisti tutkijoiden:

• karakterisoi yksityiskohtaisesti NC:n kolmiulotteinen rakenne ja tee siitä johtopäätökset erittymismekanismista (esimerkiksi neulan kapea leveys edellyttää efektoripinon avaamista ennen erittymistä),
• analysoida NC:n proteiinikomponentit altistamalla eristetyt neulat proteomiseen analyysiin (katso alla),
• NC:n eri komponenttien rooleja hahmotellaan poistamalla T3SS-geenit, eristämällä NC mutanttibakteereista ja tutkimalla mutaatioiden aiheuttamia muutoksia.

Mikroskoopia, kristallografia ja solid-state NMR-spektroskopia

Kuten lähes kaikkien proteiinien kohdalla, T3SS NC:n visualisointi on mahdollista vain elektronimikroskopialla . Ensimmäiset kuvat NC:stä (1998) osoittavat elävien bakteerien soluseinästä ulkonevia neularakenteita ja litteitä, kaksiulotteisia eristettyjä NC:itä [27] . Vuonna 2001 kuvat NC Shigella flexneristä analysoitiin digitaalisesti ja niistä laskettiin keskiarvo ensimmäisen puoli-3D NC -rakenteen tuottamiseksi [7] . Vuonna 2003 saatiin Shigella flexnerin NC:n kierteinen rakenne 16 angströmin resoluutiolla röntgenkuitudiffraktiolla [28] , ja vuotta myöhemmin julkaistiin NC Salmonella typhimuriumin 17 angströmin kolmiulotteinen rakenne [29] . . Viimeaikaiset edistysaskeleet ja lähestymistavat ovat tehneet mahdolliseksi saada korkearesoluutioisia 3D-kuvia NC:istä [30] [31] , jotka selventävät entisestään NC:iden monimutkaista rakennetta.

Lukuisia T3SS-proteiineja on kiteytetty viime vuosina. Näitä ovat NC-rakenneproteiinit, efektorit ja chaperonit. Ensimmäinen neulakompleksimonomeerin rakenne oli " Burkholderia pseudomallein " BsaL:n ​​NMR-rakenne ja sitten Shigella flexnerin MixH:n kiderakenne , joita tutkittiin vuonna 2006 [32] [33] .

Vuonna 2012 villityypin neulakompleksien rekombinanttituotannon, solid-state NMR-spektroskopian, elektronimikroskopian [34] ja Rosetta-biopolymeerien mallintamisen yhdistelmä paljasti supramolekulaarisia rajapintoja ja lopulta Salmonella typhimurium T3SS -neulan täydellisen atomirakenteen [35] . ] . 80 aminohappotähteen PrgI-alayksiköiden on osoitettu muodostavan oikeakätisen kierteisen solmun, jossa on noin 11 alayksikköä kahta kierteen kierrosta kohti, samanlainen kuin Salmonella typhimuriumin siima . Malli paljasti myös pidennetyn aminoterminaalisen domeenin, joka sijaitsee neulan pinnalla, kun taas erittäin konservoitunut karboksipää on suunnattu onteloon [35] .

Proteomiikka

T3SS:n muodostavien proteiinien joukon tunnistamiseen on käytetty useita menetelmiä. Eristetyt neulakompleksit voidaan erottaa käyttämällä geelielektroforeesia (SDS-PAGE). Vyöhykkeet, jotka ilmestyvät värjäyksen jälkeen, voidaan leikata yksittäin geelistä ja analysoida käyttämällä proteiinisekvensointia ja massaspektrometriaa. NC:n rakenteelliset komponentit voidaan erottaa toisistaan ​​(esimerkiksi neulaosa kantaosasta), ja näitä fraktioita analysoimalla voidaan määrittää kuhunkin niistä liittyvät proteiinit. Vaihtoehtoisesti eristettyjä neulakomplekseja voidaan analysoida suoraan massaspektrometrialla ilman aiempaa elektroforeesia täydellisen kuvan saamiseksi NC- proteomista .

T3SS-estäjät

Useiden yhdisteiden on havaittu estävän T3SS:ää gramnegatiivisissa bakteereissa, mukaan lukien guadinomiini, jota Streptomyces -lajit luonnollisesti tuottavat [36] .

Kirjallisuus

• Kuninkaallisen kemian seuran välitön katsaus injektioaineen kemiaan
• Isäntä - patogeenivuorovaikutus Pseudomonas syringae pv. tomaatti ja tomaattikasvi, joka johtaa bakteeripilkkutautiin.

Muistiinpanot

1. ↑ Malli: TCDB2
2. ↑ A. Blocker, N. Jouihri u. a.: Shigella flexneri "neulakompleksin", joka on osa sen tyypin III eritystä, rakenne ja koostumus. Julkaisussa: Molecular microbiology. Band 39, Nummer 3, Helmikuu 2001, S. 652-663, ISSN 0950-382X , PMID 11169106 .
3. ↑ Salmond GP, Reeves PJ Kalvoliikenteen valvojat ja proteiinin eritys gramnegatiivisissa bakteereissa  //  Trends in Biochemical Sciences : päiväkirja. - Cell Press , 1993. - Voi. 18 , ei. 1 . - s. 7-12 . - doi : 10.1016/0968-0004(93)90080-7 . — PMID 8438237 .
4. ↑ 1 2 Gophna U., Ron EZ, Graur D. Bakteerityypin III eritysjärjestelmät ovat ikivanhoja ja kehittyneet useiden vaakasuuntaisten siirtotapahtumien seurauksena  //  Gene : päiväkirja. - Elsevier , 2003. - Heinäkuu ( nide 312 ). - s. 151-163 . - doi : 10.1016/S0378-1119(03)00612-7 . — PMID 12909351 .
5. ↑ Nguyen L., Paulsen IT, Tchieu J., Hueck CJ, Saier MH Tyypin III proteiinin eritysjärjestelmien ainesosien fylogeneettiset analyysit  //  Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology : Journal. - 2000. - huhtikuu ( osa 2 , nro 2 ) . - s. 125-144 . — PMID 10939240 .
6. ↑ Gong H., Vu GP, Bai Y., Yang E., Liu F., Lu S. Salmonella tyypin III eritysjärjestelmän tekijöiden InvJ, PrgJ, SipC, SipD, SopA ja SopB differentiaalinen ilmentyminen viljelmissä ja hiirissä   // Microbiology : Journal. - 2010. - tammikuu ( osa 156 , nro kohta 1 ). - s. 116-127 . - doi : 10.1099/mikrofoni.0.032318-0 . — PMID 19762438 .
7. ↑ 1 2 Blocker A., ​​​​Jouihri N., Larquet E., Gounon P., Ebel F., Parsot C., Sansonetti P., Allaoui A. Shigella flexneri -neulakompleksin rakenne ja koostumus, osa tyypin III erityksestä  (englanniksi)  // Mikrobiologia : päiväkirja. — Mikrobiologian seura, 2001. - Voi. 39 , ei. 3 . - s. 652-663 . - doi : 10.1046/j.1365-2958.2001.02200.x . — PMID 11169106 .
8. ↑ Galan JE, Wolf-Watz H. Proteiinin toimitus eukaryoottisoluihin tyypin III erityskoneilla  //  Nature: Journal. - 2006. - Voi. 444 , no. 7119 . - s. 567-573 . - doi : 10.1038/luonto05272 . — . — PMID 17136086 .
9. ↑ Pallen MJ; Bailey C.M.; Beatson SA Evoluutioyhteydet bakteerityypin iii eritysjärjestelmistä peräisin olevien Flih  / Yscl:n kaltaisten proteiinien ja FoF1:n toisen varren komponenttien ja vakuolaaristen ATPaasien välillä  // Protein Science : päiväkirja. - 2006. - Voi. 15 , ei. 4 . - s. 935-940 . - doi : 10.1110/ps.051958806 . — PMID 16522800 .
10. ↑ Aizawa S. Bakteerisiima ja tyypin iii eritysjärjestelmät  //  FEMS Microbiology Letters : päiväkirja. - 2001. - Voi. 202 , no. 2 . - s. 157-164 . - doi : 10.1111/j.1574-6968.2001.tb10797.x . — PMID 11520608 .
11. ↑ Doolittle WF; Zhaxybayeva, Olga. Evoluutio: Vähennettävä monimutkaisuus – bakteerisiimojen tapaus  (englanniksi)  // Current Biology  : Journal. - Cell Press , 2007. - Voi. 17 , ei. 13 . - P.R510-512 . - doi : 10.1016/j.cub.2007.05.003 . — PMID 17610831 .
12. ↑ Akeda Y., Galán JE Substraattien chaperone-vapautus ja laskostuminen tyypin III erityksessä  //  Nature : Journal. - 2005. - lokakuu ( nide 437 , nro 7060 ). - s. 911-915 . - doi : 10.1038/luonto03992 . — . — PMID 16208377 .
13. ↑ Kimbrough T.G.; Miller SI Salmonella typhimurium tyypin iii erityskomponenttien panos neulakompleksin muodostumiseen  (englanniksi)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United of America  : Journal. - 2000. - Voi. 97 , no. 20 . - P. 11008-11013 . - doi : 10.1073/pnas.200209497 . - . — PMID 10984518 .
14. ↑ YashRoy RC Gram-negatiivisten patogeenien aiheuttama eukaryoottisolumyrkytys: uusi bakteerien ulkokalvoon sitoutunut nanovesikulaarinen eksosytoosimalli tyypin III eritysjärjestelmälle  //  Toxicology International : Journal. - 2003. - Voi. 10 , ei. 1 . - s. 1-9 .
15. ↑ Zychlinsky A., Kenny B., Menard R., Prevost MC, Holland IB, Sansonetti PJ IpaB välittää Shigella  flexnerin indusoimaa makrofagien apoptoosia  // Mikrobiologia : päiväkirja. — Mikrobiologian seura, 1994. - Voi. 11 , ei. 4 . - s. 619-627 . - doi : 10.1111/j.1365-2958.1994.tb00341.x . — PMID 8196540 .
16. ↑ Hilbi H., Moss JE, Hersh D., Chen Y., Arondel J., Banerjee S., Flavell RA, Yuan J., Sansonetti PJ, Zychlinsky A. Shigellan aiheuttama apoptoosi on riippuvainen kaspaasi-1:stä, joka sitoutuu IpaB  (englanti)  // J Biol Chem  : Journal. - 1998. - Voi. 273 , nro. 49 . - P. 32895-32900 . doi : 10.1074/ jbc.273.49.32895 . — PMID 9830039 .
17. ↑ Boch, J.; Bonas, U. XanthomonasAvrBs3 Family-Type III Effectors: Discovery and Function  (englanniksi)  // Annual Review of Phytopathology  : Journal. - 2010. - Vol. 48 . - s. 419-436 . - doi : 10.1146/annurev-phyto-080508-081936 . — PMID 19400638 .
18. ↑ Moskova, MJ; Bogdanove, AJ Yksinkertainen salaus hallitsee DNA:n tunnistusta TAL Effectorsin toimesta  (englanniksi)  // Science : Journal. - 2009. - Vol. 326 , no. 5959 . - s. 1501 . - doi : 10.1126/tiede.1178817 . - . — PMID 19933106 .
19. ↑ Boch J., Scholze H., Schornack S., et ai. TAL-tyypin III efektorien DNA-sitoutumisspesifisyyden koodin rikkominen  (englanniksi)  // Science : Journal. - 2009. - joulukuu ( nide 326 , nro 5959 ). - s. 1509-1512 . - doi : 10.1126/tiede.1178811 . - . — PMID 19933107 .
20. ↑ Schraidt, O.; Lefebre, M.D.; Brunner, MJ; Schmied, W.H.; Schmidt, A.; Radics, J.; Mechtler, K.; Galan, J.E.; Marlovits, TC Salmonella typhimurium -tyypin III erityksen neulakompleksikomponenttien topologia ja organisaatio  // PLoS-patogeenit : Journal  /  Stebbins, C. Erec. - 2010. - Vol. 6 , ei. 4 . — P.e1000824 . - doi : 10.1371/journal.ppat.1000824 . — PMID 20368966 .
21. ↑ Grynberg M., Godzik A. Signalointisignaali, löydetty   // PLoS Pathog .  : lehti / Stebbins, C. Erec. - 2009. - Huhtikuu ( osa 5 , nro 4 ). — P.e1000398 . - doi : 10.1371/journal.ppat.1000398 . — PMID 19390616 .
22. ↑ Yu XJ et ai. pH:n havaitseminen solunsisäisellä salmonellalla indusoi efektorin translokaation  (englanniksi)  // Science : Journal. - 2010. - toukokuu ( nide 328 , nro 5981 ). - s. 1040-1043 . - doi : 10.1126/tiede.1189000 . - . — PMID 20395475 .
23. ↑ Medini D., Covacci A., Donati C. Proteiinihomologiaperheverkko paljastaa tyypin III ja tyypin IV eritysjärjestelmien vaiheittaisen monipuolistumisen  // PLoS Comput  . Biol.  : päiväkirja. - 2006. - Joulukuu ( osa 2 , nro 12 ). — s. e173 . - doi : 10.1371/journal.pcbi.0020173 . - . — PMID 17140285 .
24. ↑ 1 2 Saier, M. Bakteerityypin III proteiinin eritysjärjestelmien kehitys  (eng.)  // Trends in Microbiology : päiväkirja. - Cell Press , 2004. - Voi. 12 , ei. 3 . - s. 113-115 . - doi : 10.1016/j.tim.2004.01.003 . — PMID 15001186 .
25. ↑ McCann HC, Guttman DS Tyypin III eritysjärjestelmän ja sen efektorien kehitys kasvien ja mikrobien vuorovaikutuksessa  // New Phytol  . : päiväkirja. - 2008. - Voi. 177 , nro. 1 . - s. 33-47 . - doi : 10.1111/j.1469-8137.2007.02293.x . — PMID 18078471 .
26. ↑ Abby, Sophie S.; Rocha, Eduardo PC Ei-lipullinen tyypin III eritysjärjestelmä kehittyi bakteerisiimosta ja monipuolistui isäntäsoluihin mukautuneiksi järjestelmiksi  //  PLOS Genetics : päiväkirja. - 2012. - 1. syyskuuta ( osa 8 , nro 9 ). — P. e1002983 . — ISSN 1553-7404 . - doi : 10.1371/journal.pgen.1002983 . — PMID 23028376 .
27. ↑ 1 2 Kubori T., Matsushima Y., Nakamura D., Uralil J., Lara-Tejero M., Sukhan A., Galán JE, Aizawa SI Salmonella typhimurium tyypin III proteiinin eritysjärjestelmän supramolekulaarinen rakenne  (englanti)  / / Tiede: lehti. - 1998. - huhtikuu ( nide 280 , nro 5363 ). - s. 602-605 . - doi : 10.1126/tiede.280.5363.602 . - . — PMID 9554854 .
28. ↑ Cordes FS, Komoriya K., Larquet E., Yang S., Egelman EH, Blocker A., ​​​​Lea SM Shigella flexnerin tyypin III eritysjärjestelmän neulan kierteinen rakenne  // J Biol Chem  :  Journal . - 2003. - Voi. 278 , nro. 19 . - P. 17103-17107 . - doi : 10.1074/jbc.M300091200 . — PMID 12571230 .
29. ↑ Marlovits TC, Kubori T., Sukhan A., Thomas DR, Galán JE, Unger VM Rakenteellisia näkemyksiä tyypin III erityksen neulakompleksin kokoamisesta  //  Science : Journal. - 2004. - Voi. 306 , no. 5698 . - s. 1040-1042 . - doi : 10.1126/tiede.1102610 . - . — PMID 15528446 .
30. ↑ Sani M., Allaoui A., Fusetti F., Oostergetel GT, Keegstra W., Boekema EJ Shigella flexnerin tyypin III erityslaitteen neulakompleksin rakennejärjestely  //  Micron : Journal. - 2007. - Voi. 38 , ei. 3 . - s. 291-301 . - doi : 10.1016/j.micron.2006.04.007 . — PMID 16920362 . Arkistoitu alkuperäisestä 18. lokakuuta 2019.
31. ↑ Hodgkinson JL, Horsley A., Stabat D., Simon M., Johnson S., da Fonseca PC, Morris EP, Wall JS, Lea SM, Blocker AJ Shigella T3SS:n transmembraanialueiden kolmiulotteinen rekonstruktio paljastaa 12-kertaisen symmetrian ja uusia ominaisuuksia kaikkialla  // Nat Struct Mol Biol  : Journal  . - 2009. - Vol. 16 , ei. 5 . - s. 477-485 . - doi : 10.1038/nsmb.1599 . — PMID 19396171 .
32. ↑ Zhang, L; Wang, Y; Keräily, WL; Poiminta, W.D.; De Guzman, RN Monomeerisen BsaL:n ​​liuosrakenne, Burkholderia pseudomallein tyypin III erityksen neulaproteiini. (Englanti)  // Journal of Molecular Biology : päiväkirja. - 2006. - 2. kesäkuuta ( nide 359 , nro 2 ). - s. 322-330 . - doi : 10.1016/j.jmb.2006.03.028 . — PMID 16631790 .
33. ↑ Deane JE, Roversi P., Cordes FS, Johnson S., Kenjale R., Daniell S., Booy F., Picking WD, Picking WL, Blocker AJ, Lea SM Tyypin III eritysjärjestelmän neulan molekyylimalli: vaikutukset isäntäsolutunnistin  (englanniksi)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United of America  : Journal. - 2006. - Voi. 103 , no. 33 . - P. 12529-12533 ​​. - doi : 10.1073/pnas.0602689103 . - . — PMID 16888041 .
34. ↑ Galkin V.E.; Schmied W.H.; Schraidt O; Marlovits TC ja Egelman. Salmonella typhimurium tyypin III eritysjärjestelmän neulan rakenne osoittaa eroa siimajärjestelmästä  // J Mol  Biol : päiväkirja. - 2010. - Vol. 396 , no. 5 . - s. 1392-1397 . - doi : 10.1016/j.jmb.2010.01.001 . — PMID 20060835 .
35. ↑ 1 2 Loquet A., Sgourakis NG, Gupta R., Giller K., Riedel D., Goosmann C., Griesinger C., Kolbe M., Baker D., Becker S., Lange A. Tyypin atomimalli III eritysjärjestelmän neula  (englanniksi)  // Luonto: päiväkirja. - 2012. - Vol. 486 , no. 7402 . - s. 276-279 . - doi : 10.1038/luonto11079 . — . — PMID 22699623 .
36. ↑ Holmes, T.C.; toukokuu, AE; Zaleta Rivera, K.; Ruby, JG; Skewes-Cox, P.; Fischbach, M.A.; Derisi, JL; Iwatsuki, M.; Ōmura, S.; Khosla, C. Molecular Insights into the Biosynthesis of Guadinomine: A Type III -eritysjärjestelmän estäjä  //  Journal of the American Chemical Society : päiväkirja. - 2012. - Vol. 134 , nro. 42 . - P. 17797-17806 . doi : 10.1021 / ja308622d . — PMID 23030602 .