Bioortogonaaliset reaktiot ovat kemiallisia reaktioita , jotka voivat tapahtua elävissä järjestelmissä häiritsemättä luonnollisia biokemiallisia prosesseja [1] [2] [3] . Bioortogonaalisiin reaktioihin osallistuvia funktionaalisia ryhmiä ei pääsääntöisesti löydy biomolekyyleistä, ne reagoivat nopeasti ja selektiivisesti keskenään elävien solujen olosuhteissa ja ovat inerttejä muiden kehossa olevien yhdisteiden suhteen. Termiä ehdotti Caroline Bertozzi vuonna 2003 [4] . Reaktioiden nimi perustuu sanan " ortogonaalinen " kuvaannolliseen merkitykseen, eli mistään riippumattomaan , ja tarkoittaa keinotekoisten ja luonnollisten prosessien keskinäistä riippumattomuutta .
Huolimatta siitä, että orgaanisen kemian alalla on löydetty, tutkittu ja kuvattu suuri määrä kemiallisia reaktioita, käytännössä mitään niistä ei voida suorittaa solussa tai organismissa siten, että se vaikuttaisi vain tutkijaa kiinnostavaan yhdisteeseen ( proteiini , DNA , metaboliitti jne.). Tämä johtuu siitä, että biomolekyylit sisältävät suuren määrän funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat reaktiivisuudeltaan hyvin samanlaisia (pääasiassa nukleofiilisiä ), ja reaktio, jossa tutkittava yhdiste pääsee sisään, vaikuttaa väistämättä muihin molekyyleihin, jotka sisältävät samanlaisia funktionaalisia ryhmiä, mikä ei välttämättä täytä ryhmän tavoitteita. tutkimusta, mutta myös häiritsevät solun luonnollista toimintaa, mikä tekee sen tutkimisen mahdottomaksi [5] . Samalla kemiallisten reaktioiden suorittaminen solun sisällä on hyödyllinen tutkimusväline, sillä sen avulla voit merkitä tutkittavat biomolekyylit fluoresoivilla , affiniteetti- ja massaspektrometrisilla merkinnöillä, mikä mahdollistaa näiden biomolekyylien havainnoinnin myöhemmin sopivin tutkimusmenetelmin. esimerkiksi fluoresoivan mikroskoopin avulla . Bioortogonaaliset reaktiot on suunniteltu täyttämään tämä aukko, koska ne ovat täysin vieraita solulle, tapahtuvat keinotekoisesti lisättyjen funktionaalisten ryhmien välillä ja niillä on vain vähän vaikutusta solun toimintaan [3] .
Bioortogonaalisen reaktion käyttö käytännössä tapahtuu yleensä kahdessa vaiheessa. Ensinnäkin tutkittava yhdiste modifioidaan bioortogonaalisella funktionaalisella ryhmällä solun sisällä. Sitten järjestelmään viedään pienimolekyylipainoinen leima, joka sisältää komplementaarisen funktionaalisen ryhmän, ja bioortogonaalisen reaktion seurauksena tämän yhdisteen selektiivinen modifikaatio (leimaus) tapahtuu [3] [5] . Myöhemmin esitellyn etiketin avulla voit seurata muunnettua alustaa.
Bioortogonaaliset reaktiot ovat nyt tehneet mahdolliseksi tutkia erilaisia biomolekyylejä , kuten glykaaneja , proteiineja [6] ja lipidejä [7] , reaaliajassa elävissä järjestelmissä ilman sytotoksisuutta . On kehitetty useita bioortogonaalisuuden vaatimuksia täyttäviä kemiallisia reaktioita, muun muassa atsidien 1,3-dipolaarinen sykloadditio syklooktyyneiksi (kutsutaan myös kuparittomaksi napsautusreaktioksi ) [8] , nitronit syklooktyyneiksi [9 ] ] , oksiimien tai hydratsonien muodostuminen karbonyyliyhdisteistä [10] , tetratsiinien reaktio syklo - okteenien kanssa [11] , isonitriilien napsautusreaktio ja kvadrisyklaaniligaatio [13] .
Ensimmäinen havainto selektiivisestä kovalenttisesta modifikaatiosta käyttämällä kemiallista reaktiota soluolosuhteissa ilmestyi R. Qianin et al.:n töissä, jotka käyttivät fluoreseiinia kahdella arsiinifunktionaalisella ryhmällä modifioivat selektiivisesti proteiinia, johon tetrakysteiinifragmentti , joka on käytännössä puuttuu nisäkkäiden proteiineista , otettiin käyttöön aiemmin [14] . Tämä lähestymistapa mahdollisti pienen fluoresoivan leiman lisäämisen proteiiniin, kun taas tuolloin vakiomenetelmänä oli saada hybridejä vihreän fluoresoivan proteiinin tai sen analogien kanssa [15] , jotka ovat paljon suurempia ja sen seurauksena joskus häiritsevät tutkittavan proteiinin normaalia toimintaa.
Tämä lähestymistapa sai kemistit etsimään kemiallisia reaktioita ja funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat täysin vieraita luonnollisille yhdisteille, ja biologit keksimään tapoja tuoda bioortogonaalisia toimintoja biomolekyyleihin. Ensimmäinen askel oli oivallus, että biomolekyylit sisältävät pääasiassa nukleofiilisiä ryhmiä, kun taas elektrofiiliset ryhmät ovat niissä paljon harvinaisempia. Esimerkiksi ketoneja ja aldehydejä ei esiinny proteiineissa, mutta samalla ne osoittavat reaktiivisuutta hydratsidi- ja hydroksiamiiniryhmiä kohtaan, joita ei myöskään esiinny biomolekyyleissä. Tästä johtuen 1990-luvun lopulla glykaanien ja proteiinien muuntaminen metabolisesti tuotujen ketoneja sisältävien sokereiden ja aminohappojen avulla tuli mahdolliseksi solun sisällä. Ketonit ja aldehydit olivat kuitenkin läsnä pienimolekyylisissä metaboliiteissa (sokerit, pyruvaatti , pyridoksaalifosfaatti jne.), eli ne eivät olleet täysin bioortogonaalisia [16] .
Myöhemmin kemistit etsivät bioortogonaalisia reaktioita, jotka tapahtuivat täysin luonnottomien funktionaalisten ryhmien välillä. Staudingerin reaktio oli ensimmäinen kemiallinen reaktio, joka mukautettiin suorittamaan muutoksia solun sisällä. Tähän reaktioon tuleva atsidiryhmä kuuluu pehmeisiin elektrofiileihin, jotka eivät pysty reagoimaan luonnossa yleisimpien kovien nukleofiilien kanssa. Atsidin kumppani oli fosfiini, pehmeä nukleofiili, jonka G. Staudinger ehdotti vuonna 1919 [17] . Vuonna 2000 C. Bertozzi modifioi Staudingerin reaktiota, ja sitä käytettiin bioortogonaalisena Staudinger-ligaationa useiden biomolekyylien leimaamiseen sekä elävissä soluissa että kokonaisissa organismeissa [18] .
Samaan aikaan alkoi kehittyä napsautuskemia - kemiallinen käsite, joka kuvaa orgaanisten yhdisteiden kirjastojen valmistusta nopeilla ja luotettavilla reaktioilla, jotka mahdollistavat molekyylien kokoamisen pienistä rakennuspalikoista [19] . Useista tämän käsitteen täyttävistä reaktioista kuparikatalysoitu atsidi-alkyenisykloadditio on löytänyt laajimman sovelluksen biomolekyylien in vitro -muokkaukseen [20] . Kuparikatalyytin myrkyllisyyden vuoksi tällaista reaktiota ei kuitenkaan voitu käyttää elävissä soluissa tai organismeissa. C. Bertozzin ryhmä loi ei-katalyyttisen muunnelman tästä reaktiosta, joka tunnetaan nimellä stress-facilitated atsidi-alkyne-sykloadditio (SPAAC), joka on lupaava bioortogonaalinen reaktio [8] .
Tällä hetkellä uusien bioortogonaalisten reaktioiden etsintä jatkuu, jotta substraattien rinnakkaismodifiointi voitaisiin suorittaa samassa biologisessa järjestelmässä.
Ihannetapauksessa bioortogonaalisen reaktion tulisi täyttää seuraavat erityisehdot [3] [4] :
Tämän reaktion kehitti C. Bertozzin ryhmä vuonna 2000 atsidien ja triaryylifosfiinien välisen klassisen Staudinger-reaktion [18] perusteella . Tästä reaktiosta tuli bioortogonaalisen kemian alan esi-isä, koska siinä reagoivia ryhmiä (atsidit, fosfiinit) ei ole biomolekyyleissä, mutta nyt sitä ei käytetä yhtä laajasti. Staudinger-ligaatiota on käytetty biomolekyylien modifioimiseen sekä elävissä soluissa että hiirissä [4] .
Staudingerin reaktiossa atsidiryhmä toimii pehmeänä elektrofiilina , joka reagoi pehmeiden nukleofiilien , kuten fosfiinien , kanssa . Useimmat biologiset nukleofiilit ovat sitä vastoin jäykkiä nukleofiilejä, jotka eivät reagoi atsidien kanssa. Lisäksi Staudinger-ligaatio etenee vesipitoisessa väliaineessa, jolloin muodostuu stabiili tuote [18] .
Fosfiineja ei esiinny luonnollisissa biomolekyyleissä [21] , eivätkä ne palauta disulfidisidoksia .
Lääkkeiden ( atsidotymidiini ) esimerkkiä käyttäen atsidien on osoitettu olevan biologisesti yhteensopivia . Atsidiryhmän pienen koon ansiosta se on helppo viedä biomolekyyleihin aineenvaihduntareittien kautta [8] .
Staudingerin reaktion perusta on fosfiinin nukleofiilinen hyökkäys atsidiryhmän terminaalista typpiatomia vastaan muodostaen fosfatsidi 1 :tä . Sitten fosfatsidi 1 muunnetaan iminofosforaaniksi 3 , johon liittyy typen vapautuminen, minkä jälkeen iminofosforaanin hydrolyysi tapahtuu amiinin ja fosfiinioksidin muodostuessa. Biokonjugaation alan sovellutuksia varten reaktiota modifioitiin lisäämällä esteriryhmä yhden fosfiinin aryylisubstituentin orto -asemaan. Tuloksena olevan iminofosforaanin 3 hyökkäyksen seurauksena tähän ryhmään muodostuu bisyklinen tuote 4 , jonka hydrolyysi johtaa stabiilin amidisidoksen muodostumiseen substraatin ja lisätyn leiman välille. Reaktion nopeutta rajoittava vaihe on atsidiryhmän hyökkäys fosfiinimolekyylin toimesta [22] .
Tämän reaktion suurin haittapuoli on, että fosfiinit hapettavat hitaasti elävissä järjestelmissä hapen vaikutuksesta. Lisäksi ne todennäköisesti metaboloituvat sytokromi P450 :n toimesta [4] . Staudingerin mukainen ligaatio etenee melko hitaasti, toisen kertaluvun kinetiikan mukaan, nopeusvakiolla noin 0,0020 M −1 s −1 [4] . Yritykset nopeuttaa nukleofiilistä hyökkäystä lisäämällä elektroneja luovuttavia ryhmiä aryylisubstituentteihin kiihdyttävät reaktiota, mutta myös fosfiinin hapettumisnopeus kasvaa.
Hidas reaktionopeus vaatii käytetyn fosfiinin pitoisuuden lisäämistä, mikä lisää ylimääräisen leiman tuottamaa taustasignaalia. Tätä ongelmaa yritettiin ratkaista: syntetisoitiin fluorogeenisiä fosfiineja, jotka perustuvat fluoreseiiniin [23] ja kumariiniin [24] , joiden toiminta perustuu fluoresenssin muodostumiseen vasta biomolekyyliin sisällyttämisen jälkeen, mikä mahdollisti suurempi hyppy säteilyn intensiteetissä reaktion seurauksena. Tällä hetkellä reaktion kinetiikka on edelleen vakava este sen laajalle leviämiselle.
Kupariton atsidi-alkyenisykloadditio on bioortogonaalinen reaktio, jonka C. Bertozzi on kehittänyt Huisgen-reaktion aktivoituna versiona . Toisin kuin kuparikatalysoitu atsidi-alkyenisykloadditio ( CuAAC , Cu-katalysoitu atsidi-alkyenisykloadditio), tämä reaktion muunnelma etenee suuremmalla nopeudella johtuen kulmajännityksen poistamisesta syklo-oktyynimolekyylistä additiotuotteen muodostumisen aikana. Siksi tästä reaktiosta tuli tunnetuksi kanta-promoted atsidi-alkyenisykloadditio ( SPAC ). Tämä modifikaatio mahdollistaa myrkyllisen kuparikatalyytin käytön välttämisen ja kuparittoman reaktion käytön elävissä soluissa ja organismeissa.
Klassinen kuparilla katalysoitu atsidi-alkyenisykloadditio on erittäin nopea ja tehokas biokonjugaatioreaktio , mutta sitä ei voida käyttää elävissä soluissa Cu + -ionien toksisuuden vuoksi . Myrkyllisyys johtuu kuparikatalyyttien tuottamien reaktiivisten happilajien muodostumisesta.
Ligandit on optimoitu estämään haitalliset vaikutukset biomolekyyleihin, mutta on osoitettu, että myös erilaiset ligandiympäristöt komplekseissa vaikuttavat aineenvaihduntaan, koska ne aiheuttavat ei-toivottuja muutoksia soluprosesseihin [25] .
Atsidiryhmä on bioortogonaalinen, koska se on melko pieni (sillä on vähän vaikutusta molekyylin tunkeutumiseen soluun), metabolisesti stabiili, eikä sitä esiinny natiivissa biomolekyylissä. Vaikka atsidit eivät ole kaikkein reaktiivisimpia yhdisteitä 1,3-dipolaarisessa additiossa, ne ovat edullisia, koska modifiointiolosuhteissa ei esiinny sivureaktioita [26] . Syklo-oktyynifragmentti on suurempi, mutta sillä on in vivo -muokkaukseen vaadittava ortogonaalisuus ja stabiilisuus . Syklooktiinit ovat pienimmät stabiilit sykliset alkyynit . Niiden syklien laskettu kulmajännitys on 19,9 kcal/mol [27] .
Reaktio etenee tavanomaisena 1,3-dipolaarisena sykloadditiona , jossa on sovitettu perisyklinen elektronisiirto. 1,3-dipolin ambivalenttinen luonne tekee mahdottomaksi määrittää atsidissa olevan elektrofiilisen ja nukleofiilisen keskuksen, joten kuva elektronin siirtymäsuunnasta on merkityksetön. Laskelmat osoittavat kuitenkin, että sisäisessä typpiatomissa on suurin negatiivinen varaus [28] .
Kupariton atsidi-alkyenisykloadditio on mukautettu käyttämään nitroneita atsidien sijasta . Tässä tapauksessa N -substituoituja isoksatsoliineja muodostuu reaktiotuotteina . Reaktionopeus kasvaa vesipitoisessa väliaineessa ja noudattaa toisen kertaluvun kinetiikkaa vakiolla 12 - 32 M – 1 s - 1 riippuen nitronin substituenteista. Huolimatta reaktion suuresta nopeudesta, sen haittana on vaikeus viedä nitronia biomolekyyliin metabolisella leimauksella. Reaktiota käytettiin mallipeptidin modifiointiin ja proteiinin pegylaatioon [9] .
Vuonna 2009 kehitettiin nitriilioksidien dipolaarinen sykloadditioreaktio norborneeniksi . Erityisesti sitä on sovellettu oligonukleotidien synteettiseen modifiointiin . Norborneeni valittiin dipolarofiiliksi stressin edistämän reaktiivisuuden ja stabiilisuuden välisen tasapainon vuoksi. Tämän reaktion haittoja ovat nitriilioksidin korkea elektrofiilisyys, joka johtaa sivureaktioihin, sekä alhainen reaktionopeus [29] .
Oksanonorbornadieenin sykloadditioreaktio atsidien kanssa etenee, jolloin furaani eliminoituu retro-Diels-Alder-reaktiolla. Oksanorbornadieenin rengasjännitys ja elektronihäviö lisäävät sen reaktiivisuutta sykloadditiota rajoittavassa vaiheessa. Furaanin pilkkoutuminen tapahtuu nopeasti, kun muodostuu stabiili 1,2,3- triatsoli [30] . Alustavat tutkimukset ovat osoittaneet tämän reaktion hyödyllisyyden peptidien modifioinnissa , ja sitä on käytetty myös kuvantamisyhdisteiden luomisessa SPECT :ssä [31] .
S - tetratsiinien ja ( E )-syklo -okteenien sykloadditio etenee Diels-Alder-reaktiona , jota seuraa retro-Diels-Alder-reaktio, jossa vapautuu typpeä. Reaktio etenee erittäin nopeasti toisen kertaluvun nopeusvakiolla 2000 M – 1 s– 1 ( metanoli - vesi -järjestelmässä 9:1 ), mikä mahdollistaa biomolekyyleiden modifioinnin erittäin pienillä pitoisuuksilla.
Laskelma osoitti, että ( Z )-syklo-okteenien jännitysenergia on 7,0 kcal/mol, mikä on pienempi kuin syklo-oktaanissa (12,4 kcal/mol), johtuen kahden renkaan välisen vuorovaikutuksen häviämisestä. Päinvastoin, kaksoissidoksen ( E )-konfiguraatio lisää suuresti rengasjännitystä (17,9 kcal/mol), millä on positiivinen vaikutus reaktionopeuteen [32] . Dienofiilina käytetään 3,6-diaryyli- s - tetratsiinia, joka sisältää substituentteja estämään vuorovaikutusta veden kanssa. Typen vapautuminen toisessa vaiheessa tekee reaktiosta peruuttamattoman [33] .
Veden on havaittu kiihdyttävän tetratsiinien reaktiota syklo-okteenien kanssa. Norborneeneja käytettiin myös dienofiileina, mutta reaktio eteni paljon hitaammin (1 M – 1 s – 1 vesipitoisessa väliaineessa). Tetratsiinien reaktiota ( E )-syklo-okteenin kanssa käytettiin elävien solujen leimaamiseen fluoresoivalla leimalla [34] ja polymeerien yhdistämiseen [35] .
Isonitriilien napsautusreaktio on [4+1]-sykloadditio, jota seuraa retro-Diels-Alder-reaktio N2:n vapauttamiseksi [ . Tästä syystä reaktio on peruuttamaton. Tuote on stabiili, jos käytetään tertiääristä isonitriiliä. Primääristen ja sekundääristen isonitriilien tapauksessa muodostuu imiini, joka sitten hydrolysoituu nopeasti (näkyy kaaviossa punaisena).
Isonitriili on hyvä bioortogonaalinen ryhmä pienen koonsa, stabiiliutensa, myrkyttömyytensä ja biologisten järjestelmien puuttumisen vuoksi. [4+1]-sykloadditioreaktio etenee kuitenkin hitaasti toisen asteen nopeusvakiolla 10–2 M – 1 s– 1 .
Tetratsoli voi käydä läpi valoindusoidun sykloeliminaatioreaktion, jossa vapautuu typpeä. Tällöin muodostuu lyhytikäinen 1,3- dipoli , joka tulee 1,3-dipolaariseen sykloadditioon alkeenien kanssa , mikä johtaa pyratsoliiniaddukteihin [36] .
Valoinduktio etenee lyhytaikaisella altistuksella valolle (aallonpituus riippuu tetratsolista). Valotusaika valitaan siten, että se vähentää valon aiheuttamia vaurioita soluille. Reaktio kiihtyy vesipitoisessa väliaineessa ja antaa yhden regioisomeerin . Tämän lähestymistavan edut ovat mahdollisuus hallita reaktiota tilallisesti ja ajallisesti. Reaktion käyttöä yksinkertaistaa myös se, että alkeeneja tai tetratsoleja voidaan viedä biomolekyyleihin yksinkertaisilla biologisilla menetelmillä. Lisäksi on luotu fluorogeeninen tetratsoli, jonka avulla on mahdollista seurata reaktion astetta ajassa [37] .
Kvadrisyklaaniligaatiossa jännittynyt kvadrisyklaani siirtyy [2+2+2]-sykloadditioon π-järjestelmien kanssa. Kvadrisyklaania ei esiinny natiivissa biomolekyylissä, se ei reagoi niiden kanssa (molekyylin kyllästymisen vuoksi), sillä on suhteellisen pieni koko ja voimakas jännite (≈ 80 kcal/mol). Se on kuitenkin erittäin stabiili huoneenlämmössä ja vesiympäristössä fysiologisessa pH:ssa. Se pystyy selektiivisesti reagoimaan elektronivajaisten π-järjestelmien kanssa, mutta ei yksinkertaisten alkeenien , alkyynien tai syklo -oktyynien kanssa [13] .
Bis(ditiobentsyyli)nikkeli(II) valittiin toiseksi reagenssiksi reaktiivisuuden seulonnan tuloksena. Valon aiheuttaman inversion estämiseksi norbornadieeniksi reaktioon lisätään dietyyliditiokarbamaattia , joka kelaatoi nikkelin tuloksena olevassa tuotteessa. Reaktio etenee toisen kertaluvun nopeusvakiolla 0,25 M −1 s −1 (vesipitoisessa väliaineessa).
Käyttämällä tätä reaktiota sekä kuparitonta atsidi-alkyyni-sykloadditiota ja oksiimin muodostumisreaktiota luotiin menetelmä kolmen substraatin leimaamiseen samanaikaisesti ilman näiden kolmen reaktion keskinäistä häiriötä [13] .
Useita bioortogonaalisia reaktioita, pääasiassa Staudinger-ligaatiota ja kuparitonta atsidi-alkyenisykloadditiota, käytetään laajasti biokonjugaation ja kemiallisen biologian aloilla .
Solujen proteiinisynteesijärjestelmät sekä entsyymit voivat tuoda ei-luonnollisia aminohappoja proteiinirakenteisiin sekoittaen ne luonnollisiin aminohappoihin. Erityisesti havaittiin, että bakteerien ravintoalustassa olevan metioniinin korvaaminen homopropargyyliglysiinillä ( Hpg ) tai atsidohomoalaniinilla ( Aha ) mahdollisti näiden synteettisten aminohappojen integroinnin solun syntetisoimiin proteiineihin. Tällaiset proteiinit sisälsivät bioortogonaalisia funktionaalisia ryhmiä, atsidia tai alkyyniä, ja biotiinin ja täydentävällä funktionaalisella ryhmällä (fosfiini, syklo-oktyyni tai atsidi) varustettujen fluoresoivien väriaineiden lisääminen soluun mahdollisti näiden proteiinien selektiivisen leimaamisen ja tutkimisen. Lisäksi atsidohomoalaniinia ja homopropargyyliglysiiniä on käytetty samanaikaisesti kahden erityyppisen proteiinin muuntamiseen rinnakkain [38] .
Bioortogonaalinen kemia on löytänyt sovelluksen myös proteiinien aktiivisuusprofiloinnissa joilla on affiniteettia tiettyyn ligandiin . Tätä varten ligandi leimataan bioortogonaalisella funktionaalisella ryhmällä ja viedään soluun. Kun proteiinit ovat sitoutuneet ligandiin, solu tuhoutuu ja kaikki proteiinit viedään reaktioon jollakin leimalla, joka sisältää komplementaarisen reaktiivisen ryhmän. Tässä tapauksessa leima viedään vain ligandiin, ja sen avulla on mahdollista erottaa ja eristää vain ne proteiinit, jotka liittyvät tähän ligandiin [39] .
Glykaaneja ei koodata suoraan geneettisesti, eikä niillä ole proteiinien spesifistä aktiivisuutta, joten geneettisiä tai affiniteettileimausmenetelmiä ei voida soveltaa niihin. Glykaaneja voidaan kuitenkin modifioida metabolisesti modifioiduilla synteettisillä hiilihydraateilla ( siaalihappo , N - asetyyligalaktosamiini, N - asetyyliglukosamiini jne.), jotka sisältävät atsidiryhmiä. Glykaanit, joissa oli upotettuja atsidiryhmiä, vietiin Staudinger-ligaatioon biotiinireagenssilla ja niitä tutkittiin virtaussytometrisesti [18] .