Polymeraasiketjureaktio

Polymeraasiketjureaktio ( PCR ) on molekyylibiologian menetelmä, jonka avulla voidaan saavuttaa merkittävä lisäys tiettyjen nukleiinihappofragmenttien ( DNA tai RNA ) pienissä pitoisuuksissa biologisessa materiaalissa (näytteessä).

DNA- monistuksen lisäksi PCR mahdollistaa monia muita manipulaatioita nukleiinihapoilla ( mutaatioiden tuominen , DNA-fragmenttien silmukointi) ja sitä käytetään laajalti biologisessa ja lääketieteellisessä käytännössä esimerkiksi sairauksien (perinnöllinen, tarttuva) diagnosointiin, isyyden selvittämiseen . kloonata geenejä , eristää uusia geenejä .

Historia

1970-luvun alussa norjalainen tiedemies Kjell Kleppe Nobel-palkitun Hara Gobinda Koranan laboratoriosta ehdotti menetelmää DNA:n monistamiseksi käyttämällä paria lyhyitä yksijuosteisia DNA-molekyylejä - synteettisiä alukkeita [1] . Tuolloin ajatus jäi kuitenkin toteutumatta. Polymeraasiketjureaktion (PCR) keksi vuonna 1983 amerikkalainen biokemisti Kary Mullis [2] [3] . Hänen tavoitteenaan oli luoda menetelmä, joka mahdollistaisi DNA:n monistamisen useiden peräkkäisten alkuperäisen DNA-molekyylin kopioiden aikana käyttämällä DNA- polymeraasientsyymiä . Ensimmäinen julkaisu PCR-menetelmästä julkaistiin marraskuussa 1985 Science -lehdessä [4] . Menetelmä on mullistanut molekyylibiologian ja lääketieteen. Vuonna 1993 Kary Mullis sai tästä Nobelin kemian palkinnon [5] .

Menetelmän käytön alussa jokaisen kuumennus-jäähdytyssyklin jälkeen reaktioseokseen oli lisättävä DNA-polymeraasia , koska se inaktivoitiin korkeassa lämpötilassa, joka oli tarpeen DNA-kierteen säikeiden erottamiseksi. Reaktiomenetelmä oli suhteellisen tehoton ja vaati paljon aikaa ja entsyymiä. Vuonna 1986 polymeraasiketjureaktiomenetelmää parannettiin merkittävästi. Termofiilisten bakteerien DNA-polymeraasien käyttöä on ehdotettu [6] . Nämä entsyymit osoittautuivat lämpöstabiileiksi ja kestivät monia reaktiojaksoja. Niiden käyttö mahdollisti PCR:n yksinkertaistamisen ja automatisoinnin. Yksi ensimmäisistä lämpöstabiileista DNA-polymeraaseista eristettiin Thermus aquaticus -bakteereista ja nimettiin Taq - polymeraasiksi . Tämän polymeraasin haittana on melko suuri todennäköisyys viedä virheellinen nukleotidi, koska tästä entsyymistä puuttuu virheenkorjausmekanismi (3'→5' - eksonukleaasiaktiivisuus ). Polymeraaseilla Pfu ja Pwo , jotka on eristetty arkeasta , on tällainen mekanismi; niiden käyttö vähentää merkittävästi mutaatioiden määrää DNA:ssa, mutta niiden työskentelynopeus (prosessiivisuus) on pienempi kuin Taq . Taq :n ja Pfu :n seoksia käytetään nyt sekä suuren polymerointinopeuden että suuren kopiointitarkkuuden saavuttamiseksi.

Menetelmän keksimisen aikaan Kary Mullis työskenteli synteettisenä kemistinä (hän ​​syntetisoi oligonukleotideja, joita käytettiin sitten pistemutaatioiden havaitsemiseen hybridisoimalla genomisen DNA:n kanssa) Cetus Corporationissa , joka patentoi PCR-menetelmän. Vuonna 1992 Cetus myi menetelmän oikeudet ja patentin Taq - polymeraasin käyttöön Hofmann-La Rochelle 300 miljoonalla dollarilla. Kuitenkin kävi ilmi, että Neuvostoliiton biokemistit A. Kaledin , A. Slyusarenko ja S. Gorodetsky luonnehtivat Taq -polymeraasia vuonna 1980 [7] ja myös 4 vuotta ennen tätä Neuvostoliiton julkaisua, eli vuonna 1976, amerikkalaiset biokemistit Alice. Chien, David B. Edgar ja John M. Trela ​​[8] . Tämän seurauksena Promega yritti pakottaa Rochen luopumaan yksinoikeudestaan ​​tähän entsyymiin [9] oikeudessa . Amerikkalainen PCR-menetelmän patentti päättyi maaliskuussa 2005.

PCR:n suorittaminen

Menetelmä perustuu tietyn DNA -nukleiinihapon osan moninkertaiseen selektiiviseen kopioimiseen käyttämällä entsyymejä keinotekoisissa olosuhteissa ( in vitro ). Tässä tapauksessa vain se alue, joka täyttää määritellyt ehdot, kopioidaan ja vain jos se on tutkittavassa otoksessa. Toisin kuin DNA:n monistuminen elävissä organismeissa ( replikaatio ), suhteellisen lyhyet DNA- osuudet monistetaan PCR:llä . Perinteisessä PCR-prosessissa replikoituneiden DNA-alueiden pituus on enintään 3000 emäsparia (3 kbp [10] ). Erilaisten polymeraasien seoksen avulla, lisäaineita käyttämällä ja tietyissä olosuhteissa PCR-fragmentin pituus voi olla 20-40 tuhatta emäsparia. Tämä on silti paljon vähemmän kuin eukaryoottisolun kromosomaalisen DNA: n pituus . Esimerkiksi ihmisen lyhimmän ydinkromosomin (kromosomi 21) pituus on 46,71 miljoonaa emäsparia [11] .

Reaktion komponentit

PCR:ää varten tarvitaan yksinkertaisimmassa tapauksessa seuraavat komponentit:

• DNA-templaatti , joka sisältää monistettavan DNA-osan .
• Kaksi aluketta , jotka ovat komplementaarisia halutun DNA-fragmentin eri juosteiden vastakkaisille päille.
• Lämpöstabiili DNA-polymeraasi  on entsyymi , joka katalysoi DNA:n polymeroitumista. PCR:ssä käytettävän polymeraasin on pysyttävä aktiivisena korkeassa lämpötilassa pitkään, joten käytetään termofiileistä eristettyjä entsyymejä - Thermus aquaticus ( Taq - polymeraasi ), Pyrococcus furiosus ( Pfu- polymeraasi), Pyrococcus woesei ( Pwo- polymeraasi), Thermus thermophilus ( Tth -polymeraasi) ja muut.
• Deoksiribo nukleosiditrifosfaatit (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Polymeraasin toimintaan tarvittavat Mg 2+ -ionit .
• Puskuriliuos, joka tarjoaa tarvittavat reaktio-olosuhteet - pH , liuoksen ionivahvuus . Sisältää suoloja, naudan seerumialbumiinia .

Reaktioseoksen haihtumisen välttämiseksi koeputkeen lisätään korkealla kiehuvaa öljyä, kuten vaseliinia. Jos käytetään lämmitettyä kansisyklilaitetta, sitä ei vaadita.

Pyrofosfataasin lisääminen voi lisätä PCR-saantoa. Tämä entsyymi katalysoi pyrofosfaatin hydrolyysiä , joka on sivutuote nukleosiditrifosfaattien lisäämisestä kasvavaan DNA-juosteeseen, ortofosfaatiksi . Pyrofosfaatti voi estää PCR:n [12] .

Pohjusteet

PCR:n spesifisyys perustuu komplementaaristen kompleksien muodostumiseen templaatin ja alukkeiden , lyhyiden, 18-30 emäksen pituisten , synteettisten oligonukleotidien välille. Jokainen aluke on komplementaarinen jollekin kaksijuosteisen templaatin ketjusta ja rajoittaa monistetun alueen alkua ja loppua.

Templaatin hybridisaation jälkeen alukkeen kanssa (pariutuminen [13] ), jälkimmäinen toimii alukkeena DNA-polymeraasille templaatin komplementaarisen juosteen synteesin aikana (katso alla ).

Alukkeiden tärkein ominaisuus on aluke-matriisikompleksin sulamislämpötila (T m ).

Tm on  lämpötila, jossa puolet DNA-templaateista muodostaa kompleksin oligonukleotidialukkeen kanssa. Keskimääräinen kaava T m :n laskemiseksi lyhyelle oligonukleotidille (ja pitkille DNA-fragmenteille), kun otetaan huomioon K + -ionien ja DMSO :n pitoisuus :

missä  on nukleotidien lukumäärä alukkeessa,  on kalium-ionien molaarinen pitoisuus,  on kaikkien guaniinien ja sytosiinien summa .

Jos alukkeen pituus ja nukleotidikoostumus tai pariutumislämpötila valitaan väärin, osittain komplementaaristen kompleksien muodostuminen templaatti-DNA:n muiden alueiden kanssa on mahdollista, mikä voi johtaa epäspesifisten tuotteiden ilmaantumista. Sulamislämpötilan ylärajaa rajoittaa polymeraasin optimivaikutuslämpötila, jonka aktiivisuus laskee yli 80 °C:n lämpötiloissa.

Pohjusteita valittaessa on toivottavaa noudattaa seuraavia kriteerejä:

• GC-koostumus ~ 40–60 %;
• sulje T m -alukkeet (erot enintään 5 °C);
• epäspesifisten toissijaisten rakenteiden puuttuminen - hiusneulat [15] ja dimeerit [16] ;
• guaniini tai sytosiini on toivottava 3'-päässä , koska ne muodostavat kolme vetysidosta templaattimolekyylin kanssa, mikä tekee hybridisaatiosta stabiilimman.

Vahvistin

PCR suoritetaan vahvistimessa  - laitteessa, joka jäähdyttää ja lämmittää koeputkia säännöllisesti, yleensä vähintään 0,1 ° C:n tarkkuudella. Nykyaikaiset pyöräilylaitteet mahdollistavat monimutkaisten ohjelmien asettamisen, mukaan lukien mahdollisuuden "kuumakäynnistykseen", Touchdown PCR:ään (katso alla) ja myöhemmin monistettujen molekyylien varastointiin 4 °C:ssa. Reaaliaikaista PCR:ää varten valmistetaan fluoresoivalla tunnistimella varustettuja laitteita. Instrumentteja on saatavana myös automaattisella kannella ja mikrolevyosastolla, mikä mahdollistaa niiden integroinnin automatisoituihin järjestelmiin.

Reaktion kulku

Tyypillisesti PCR:ää suoritettaessa suoritetaan 20-35 sykliä, joista jokainen koostuu kolmesta vaiheesta. [≡]

Denaturaatio

Kaksijuosteinen DNA-templaatti kuumennetaan 94-96 °C:seen (tai 98 °C:seen, jos käytetään erityisen lämpöstabiilia polymeraasia) 0,5-2 minuutiksi niin, että DNA-ketjut hajaantuvat. Tätä vaihetta kutsutaan sulatukseksi ( denaturaatio ), koska vetysidokset kahden DNA-juosteen välillä katkeavat. Yleensä ennen ensimmäistä sykliä reaktioseosta kuumennetaan pitkä 2–5 minuuttia templaatin ja alukkeiden täydelliseksi denaturoimiseksi.

Hehkutus

Kun säikeet erotetaan, lämpötilaa alennetaan, jotta alukkeet voivat sitoutua yksisäikeiseen mallineeseen. Tätä vaihetta kutsutaan hehkutukseksi . Hehkutuslämpötila riippuu alukkeiden koostumuksesta ja valitaan yleensä 5 astetta alukkeiden sulamislämpötilaa alhaisemmaksi. Virheellinen pariutuslämpötilan valinta johtaa joko alukkeiden huonoon sitoutumiseen templaattiin (korotetussa lämpötilassa) tai sitoutumiseen väärään paikkaan ja epäspesifisten tuotteiden ilmaantuvuuteen (alhaisessa lämpötilassa). Hehkutusvaiheen aika - 30 sekuntia Samanaikaisesti, tänä aikana polymeraasi ehtii jo syntetisoida useita satoja nukleotideja. Tästä syystä on suositeltavaa valita pohjamaalit, joiden sulamispiste on yli 60°C, ja suorittaa hehkutus ja venytys samanaikaisesti, 60–72°C:ssa.

Pidentymä

DNA-polymeraasi replikoi templaattijuosteen käyttämällä aluketta alukkeena. Tämä on venymisvaihe . Polymeraasi aloittaa toisen juosteen synteesin templaattiin sitoutuneen alukkeen 3'-päästä ja liikkuu templaattia pitkin syntetisoimalla uuden juosteen suunnassa 5'-päästä 3'-päähän. Pidentymislämpötila riippuu polymeraasista. Yleisesti käytetyt Taq- ja Pfu -polymeraasit ovat aktiivisimpia 72 °C:ssa. Pidentymisaika riippuu sekä DNA-polymeraasin tyypistä että monistettavan fragmentin pituudesta. Tyypillisesti venymäajaksi otetaan yksi minuutti jokaista tuhatta emäsparia kohden. Kaikkien syklien päätyttyä suoritetaan usein lopullinen pidennysvaihe kaikkien yksijuosteisten fragmenttien viimeistelemiseksi. Tämä vaihe kestää 7-10 minuuttia.

Tietyn reaktiotuotteen määrä (rajoitettuna alukkeilla) kasvaa teoreettisesti suhteessa 2n  - 2n, missä n on reaktiosyklien lukumäärä [17] . Itse asiassa kunkin syklin hyötysuhde voi olla alle 100 %, joten todellisuudessa P ~ (1 + E) n , jossa P on tuotteen määrä, E on syklin keskimääräinen hyötysuhde.

Myös "pitkien" DNA-kopioiden määrä kasvaa, mutta lineaarisesti, joten tietty fragmentti hallitsee reaktiotuotteita.

Tarvittavan tuotteen kasvua rajoittavat eksponentiaalisesti reagenssien määrä, inhibiittorien läsnäolo ja sivutuotteiden muodostuminen. Reaktion viimeisissä sykleissä kasvu hidastuu, tätä kutsutaan "tasannevaikutukseksi".

PCR-variantit

• RPA ( Recombinase Polymerase Amplification  - recombinase polymerase amplifikaatio ) - käytetään, kun DNA/RNA monistaminen tarvitaan 15 minuutissa ilman lämpösyklistä (isoterminen reaktio) [18] [19] .
• Nested PCR  ( nested PCR ) - käytetään vähentämään reaktion sivutuotteiden määrää. Käytä kahta paria alukkeita ja suorita kaksi peräkkäistä reaktiota. Toinen alukepari monistaa DNA-alueen ensimmäisen reaktion tuotteessa.
• Käänteinen PCR  (käänteinen PCR) - käytetään, jos halutusta sekvenssistä tunnetaan vain pieni alue. Tämä menetelmä on erityisen hyödyllinen, kun on tarpeen määrittää vierekkäiset sekvenssit sen jälkeen, kun DNA on insertoitu genomiin. Käänteisen PCR:n toteuttamiseksi suoritetaan sarja DNA-leikkauksiarestriktioentsyymeillämitä seuraa fragmenttien yhdistäminen (ligaatio). Tämän seurauksena tunnetut fragmentit ovat tuntemattoman alueen molemmissa päissä, minkä jälkeen PCR voidaan suorittaa tavalliseen tapaan.
• Käänteistranskriptio -PCR:ää ( RT-PCR ) käytetään tunnetun sekvenssin monistamiseen, eristämiseen tai tunnistamiseen RNA-kirjastosta. Ennen tavanomaista PCR:ää yksijuosteinen DNA-molekyyli syntetisoidaan mRNA -templaattiin käyttämällä reversetaasia ja saadaan yksijuosteinen cDNA , jota käytetään templaattina PCR:ssä. Tämä menetelmä määrittää usein missä ja milloinnämä geenit ilmentyvät .
• Asymmetrinen PCR  (asymmetric PCR) - suoritetaan, kun on tarpeen monistaa pääasiassa yksi alkuperäisen DNA:n ketjuista. Käytetään joissakinsekvensointi-jahybridisaatioanalyysitekniikoissa. PCR suoritetaan tavalliseen tapaan, paitsi että yksi alukkeista otetaan suuri ylimäärä. Tämän menetelmän muunnelma onLinearAfter - The - E exponential - PCR (LATE-PCR)sovitetaankorkeampi (sulamispiste) kuin korkean pitoisuuden aluke. PCR suoritetaan korkeassa pariutumislämpötilassa, mikä ylläpitää reaktion tehokkuutta kaikkien syklien ajan [20] .
• Kvantitatiivista PCR :ää ( quantitative PCR, Q-PCR ) tai reaaliaikaista PCR :ää  ( reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio ) käytetään seuraamaan suoraan tietyn PCR-tuotteen määrän mittausta kussakin reaktiosyklissä. Tämä menetelmä käyttää fluoresoivasti leimattuja DNA-koettimia analysoimaan reaktiotuotteen tai interkaloituvan väriaineen SYBR Green (tai sen analogien) kertymistä. Sybr Green I tarjoaa yksinkertaisen ja kustannustehokkaan vaihtoehdon reaaliaikaiseen PCR:n havaitsemiseen ja PCR-tuotteiden kvantifiointiin ilman erityisiä fluoresoivia koettimia tai alukkeita. Monistuksen aikana SYBR Green I -väriaine liitetään PCR-tuotteiden DNA:n pienempään uraan ja lähettää voimakkaamman fluoresoivan signaalin kuin sitoutumaton väriaine, kun sitä säteilytetään sinisellä laserilla. SYBR Green I on yhteensopiva kaikkien tällä hetkellä tunnettujen reaaliaikaisten PCR-instrumenttien kanssa. SYBR Green I : n absorptiomaksimion aallonpituudella 494 nm. Pääasiallisen lisäksi väriainespektrissä on kaksi pientä lisäabsorptiomaksimia aallonpituudella 290 nm ja 380 nm. SYBR Green I : n suurin emissioon 521 nm (vihreä) [21] .
• Stepped PCR (touchdown PCR) - käyttämällä tätä lähestymistapaa alukkeiden epäspesifisen sitoutumisen vaikutus vähenee. Ensimmäiset syklit suoritetaan lämpötilassa, joka ylittää optimaalisen hehkutuslämpötilan, sitten muutaman syklin välein hehkutuslämpötilaa alennetaan vähitellen optimiarvoon. Tällä varmistetaan, että aluke hybridisoituu komplementaariseen juosteeseen koko sen pituuden ajan; kun taas optimaalisessa pariutumislämpötilassa aluke hybridisoituu osittain komplementaariseen juosteeseen. Alukkeen osittainen hybridisaatio genomisella DNA:lla johtaa epäspesifiseen monistumiseen, jos alukkeelle on riittävästi sitoutumiskohtia. Useimmissa tapauksissa ensimmäiset kymmenen PCR-sykliä voidaan suorittaa 72-75 °C:n pariutumislämpötilassa ja laskea sitten välittömästi optimilämpötilaan, esimerkiksi 60-65 °C:seen.
• Molekyylipesäkemenetelmä (PCR geelissä,pesäke-PCR) -akryyliamidigeeli polymeroidaankaikilla PCR-komponenteilla pinnalla ja PCR suoritetaan. Kohdissa, jotka sisältävät analysoitua DNA:ta, tapahtuu monistumista ja muodostuu molekyylipesäkkeitä.
• PCR nopealla cDNA-päiden monistuksella (cDNA-päiden nopea monistus, RACE-PCR).
• Pitkien fragmenttien PCR ( pitkän kantaman PCR ) on PCR-modifikaatio pidennettyjen DNA-segmenttien (10 tuhatta tai enemmän emästä) monistamiseksi. Käytetään kahden polymeraasin seosta, joista toinen on Taq - polymeraasi, jolla on korkea prosessoivisuus (eli joka pystyy syntetisoimaan pitkän DNA-ketjun yhdellä kertaa), ja toinen on DNA-polymeraasi, jolla on 3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuutta. , yleensä Pfu - polymeraasi . Toinen polymeraasi on välttämätön ensimmäisen aiheuttamien virheiden korjaamiseksi, koska Taq -polymeraasi pysäyttää DNA-synteesin, jos ei-komplementaarinen nukleotidi on lisätty. Pfu - polymeraasi poistaa tämän ei-komplementaarisen nukleotidin . Polymeraasien seos otetaan suhteessa 50:1 tai jopa alle 100:1, jolloin Taq - polymeraaseja otetaan 25-100 kertaa enemmän kuin Pfu- polymeraaseja.
• RAPD ( Random Amplification of Polymorphic DNA ), PCR polymorfisen DNA:n satunnaisella monistuksella - käytetään, kun on tarpeen erottaa toisistaan ​​geneettiseltä sekvenssiltä läheiset organismit, esimerkiksi eri lajikkeet viljelykasveista, koiraroduista tai läheltä. liittyvät mikro-organismit. Tämä menetelmä käyttää yleensä yhtä pientä aluketta (noin 10 bp). Tämä aluke on osittain komplementaarinen tutkittavien organismien satunnaisille DNA-alueille. Valitsemalla olosuhteet (alukkeen pituus, alukkeen koostumus, lämpötila jne.) on mahdollista saavuttaa tyydyttävä ero kahden organismin PCR-kuviossa.
• Ryhmäspesifinen PCR ( ryhmäspesifinen PCR ) - PCR samanlaisille sekvensseille tai eri lajien välillä käyttäen konservatiivisia alukkeita näille sekvensseille. Esimerkiksi universaalien alukkeiden valinta ribosomaalisille 18S- ja 26S - geeneille lajispesifisen geenienvälisen spacerin monistamiseksi: 18S- ja 26S -geenien sekvenssi on konservoitunut lajien välillä, joten PCR näiden geenien välillä tapahtuu kaikille lajeille tutkittavana. Tämän menetelmän vastakohta on ainutlaatuinen PCR ( ainutlaatuinen PCR ), jossa tehtävänä on valita alukkeet monistamaan vain yksi sekvenssi kaikista vastaavista.
• PCR käyttäen hot start (hot start PCR) on DNA-polymeraasia käyttävä PCR:n muunnos, jossa polymeraasiaktiivisuus estetään huoneenlämpötilassa vasta-aineilla tai pienillä molekyyleillä, jotka simuloivat vasta-aineita, kuten Affibody , eli silloin, kun reaktion asettaminen ennen ensimmäistä denaturointia PCR:ssä. Tyypillisesti ensimmäinen denaturointi suoritetaan 95 °C:ssa 10 minuutin ajan.
• Virtuaalinen PCR ( in silico PCR , elektroninen PCR, e-PCR) on matemaattinen menetelmä teoreettisen polymeraasiketjureaktion tietokoneanalyysiin käyttämällä alukesekvenssien (tai DNA-koettimien ) luetteloa genomin , kromosomin tai cDNA :n mahdollisen DNA :n monistumisen ennustamiseksi. tai mikä tahansa muu tutkittava DNA-alue.

Jos templaatin nukleotidisekvenssi on osittain tiedossa tai sitä ei tunneta ollenkaan, voidaan käyttää degeneroituneita alukkeita , joiden sekvenssi sisältää degeneroituneita kohtia, joissa mikä tahansa emäs voi sijaita. Alukesekvenssi voi olla esimerkiksi: ...ATH... jossa H on A, T tai C.

PCR:n soveltaminen

PCR:ää käytetään monilla aloilla analyyseihin ja tieteellisiin kokeisiin.

Kriminalistiikka

PCR:ää käytetään niin kutsuttujen "geneettisten sormenjälkien" vertailuun. Rikospaikalta tarvitaan näyte geneettisestä materiaalista - verta, sylkeä, siemennestettä, hiuksia jne. Sitä verrataan epäillyn geneettiseen materiaaliin. Hyvin pieni määrä DNA:ta riittää, teoriassa - yksi kopio. DNA leikataan fragmenteiksi ja monistetaan sitten PCR:llä. Fragmentit erotetaan DNA-elektroforeesilla . Syntynyttä kuvaa DNA - juovien sijainnista kutsutaan geneettiseksi sormenjäljeksi .

Isyyden vahvistaminen

Vaikka "geneettiset sormenjäljet" ovat ainutlaatuisia, perhesiteet voidaan silti muodostaa tekemällä useita tällaisia ​​sormenjälkiä. [≡] Samaa menetelmää voidaan soveltaa, pienin muutoksin, evoluutiosuhteiden määrittämiseen organismien välillä.

Lääketieteellinen diagnostiikka

PCR mahdollistaa perinnöllisten ja virusperäisten sairauksien diagnosoinnin merkittävästi nopeuttamisen ja helpon. Haluttu geeni monistetaan PCR:llä käyttäen sopivia alukkeita ja sekvensoidaan sitten mutaatioiden määrittämiseksi . Virusinfektiot voidaan havaita heti tartunnan jälkeen, viikkoja tai kuukausia ( inkubointiajan pituudesta riippuen ) ennen taudin oireiden ilmaantumista.

Henkilökohtainen lääketiede

Joskus lääkkeet ovat myrkyllisiä tai allergiaa aiheuttavia joillekin potilaille. Syynä tähän ovat osittain yksilölliset erot lääkkeiden ja niiden johdannaisten herkkyydessä ja metaboliassa . Nämä erot määräytyvät geneettisellä tasolla. Esimerkiksi yhdellä potilaalla tietty sytokromi (maksaproteiini, joka vastaa vieraiden aineiden aineenvaihdunnasta) voi olla aktiivisempi, toisessa - vähemmän aktiivinen. Sen määrittämiseksi, millainen sytokromi tietyllä potilaalla on, ehdotetaan PCR-analyysin suorittamista ennen lääkkeen käyttöä. Tätä analyysiä kutsutaan alustavaksi genotyypitykseksi ( prospektiivinen genotyypitys ).

Geenikloonaus

Geenikloonaus (jota ei pidä sekoittaa organismien kloonaukseen ) on prosessi, jossa geenit eristetään ja geeniteknisten manipulaatioiden seurauksena saadaan suuri määrä tietyn geenin tuotetta. PCR:ää käytetään geenin monistamiseen, joka sitten liitetään vektoriin  , DNA-palaan, joka siirtää vieraan geenin samaan tai toiseen organismiin, jota on helppo kasvattaa. Vektoreina käytetään esimerkiksi plasmideja tai virus-DNA:ta. Geenien lisäämistä vieraaseen organismiin käytetään yleensä tämän geenin tuotteen - RNA:n tai useimmiten proteiinin - saamiseksi. Tällä tavalla saadaan monia proteiineja teollisina määrinä käytettäväksi maataloudessa, lääketieteessä jne.

DNA-sekvensointi

Fluoresoivalla leimalla tai radioaktiivisella isotoopilla leimattuja dideoksinukleotideja käyttävässä sekvensointimenetelmässä PCR on olennainen osa, koska juuri polymeroinnin aikana fluoresoivalla tai radioaktiivisella leimalla leimattuja nukleotidien johdannaisia ​​liitetään DNA-ketjuun. Dideoksinukleotidin lisääminen syntetisoituun juosteeseen lopettaa synteesin, jolloin spesifisten nukleotidien sijainti voidaan määrittää geelissä erotuksen jälkeen.

Mutagenees

Tällä hetkellä PCR:stä on tullut tärkein menetelmä mutageneesin suorittamiseksi (muutoksia DNA:n nukleotidisekvenssiin). PCR:n käyttö mahdollisti mutageneesimenettelyn yksinkertaistamisen ja nopeuttamisen sekä sen luotettavuuden ja toistettavuuden.

Molecular sexing

Toinen PCR:n käytännön sovellusalue on molekylaarinen sukupuolen määrittäminen  – sukupuolen määrittäminen, joka perustuu miesten ja naisten DNA-tason sukupuolieroihin [22] .

Katso myös

• Nikkoentsyymivälitteinen monistus
• Helicase-riippuvainen vahvistus
• DNA
• Immuno-PCR
• DNA:n käyttö tekniikassa
• Seuraavan sukupolven sekvensointimenetelmät
• Jaksotus
• RNA-sekvensointi
• SlipChip-tekniikka
• elektroforeesi
• DNA elektroforeesi
• FastPCR
• Reaaliaikainen PCR

Muistiinpanot

1. ↑ Kleppe, K. et ai. (1971): Tutkimukset polynukleotideista. XCVI. Korjaa lyhyiden synteettisten DNA:iden replikaatioita DNA-polymeraasien katalysoimana. Julkaisussa: J. Mol. Biol. bd. 56, S. 341-361. PMID 4927950
2. ↑ Bartlett, JMS; Stirling, D. Polymeraasiketjureaktion lyhyt historia // PCR-protokollat  ​​(määrittämätön) . – 2. - 2003. - T. 226. - S. 3-6. — (Methods in Molecular Biology). — ISBN 1-59259-384-4 . - doi : 10.1385/1-59259-384-4:3 .
3. ↑ Mullis, Kary B. et ai. "Prosessi nukleiinihapposekvenssien monistamiseksi, havaitsemiseksi ja/tai kloonaamiseksi" US-patentti 4 683 195
4. ↑ Saiki RK, Scharf S., Faloona F., Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science 1985, 20. joulukuuta; 230 (4732): 1350-4; Beeta-globiinin genomisekvenssien entsymaattinen monistus ja restriktiokohdan analyysi sirppisoluanemian diagnosoimiseksi.
5. ↑ [ Kemian Nobel - palkitut 1993  ] . Haettu 29. elokuuta 2007. Arkistoitu alkuperäisestä 26. lokakuuta 2012.  (määrätön) Kemian Nobel-palkinnon saajat, 1993  (englanniksi )
6. ↑ RK Saiki, DH Gelfand, S. Stoffel, SJ Scharf, R. Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich. DNA:n aluke-ohjattu entsymaattinen monistus lämpöstabiililla DNA-polymeraasilla Arkistoitu 19. joulukuuta 2008 Wayback Machinessa . julkaisussa: Tiede . 239.1988, 487-491. ISSN 0036-8075 PMID 2448875
7. ↑ Kaledin A. S., Slyusarenko A. G., Gorodetsky S. I. // Biokemia. - 1980. - T. 45. - C. 644-651.
8. ↑ Alice Chien, David B. Edgar ja John M. Trela. Deoksiribonukleiinihappopolymeraasi Extreme Thermophilic Thermus aquaticuksesta. Jourmal of Bakteriology, syyskuu 1976, s. 1550-1557.
9. ↑ Roche ilmoittaa sovintosopimuksen Promegan kanssa (downlink) . Haettu 29. elokuuta 2007. Arkistoitu alkuperäisestä 6. lokakuuta 2008. (määrätön) 
10. ↑ 1 kbp ( englanninkielinen  kiloemäspari ) - 1000 emäsparia, DNA :n pituuden mittayksikkö
11. ↑ Venter J, et ai. (2001). Ihmisen genomin sekvenssi. Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995
12. ↑ {title} (downlink) . Haettu 1. syyskuuta 2007. Arkistoitu alkuperäisestä 29. syyskuuta 2007. (määrätön) 
13. ↑ Hehkutus ( annealing ) - DNA-fragmenttien hybridisaatio
14. ↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonukleotidien sulamislämpötilat pcr-olosuhteissa: lähin naapurikorjaukset Mg 2+ :n , deoksinukleotiditrifosfaatin ja dimetyylisulfoksidin pitoisuuksille verrattuna vaihtoehtoisiin empiirisiin kaavoihin  //  Clinical Chemistry : Journal. - 2001. - Voi. 47 , nro. 11 . - P. 1956-1961 . Arkistoitu alkuperäisestä 1. syyskuuta 2012.
15. ↑ Hiusneula  - molekyylinsisäinen itsensä täydentävä rakenne
16. ↑ Dimeeri  - molekyylien väliset rakenteet, jotka muodostuvat alukkeista keskenään tai itsensä kanssa
17. ↑ Kalenteri R. N., Sivolap Yu. M. Polymeraasiketjureaktio mielivaltaisilla alukkeilla  // Biopolymers and cell: Journal. - 1995. - T. 11 , nro 3-4 . - S. 55-65 . — ISSN 0233-7657 . (Venäjän kieli)
18. ↑ Recombinase Polymerase Amplification (RPA) – isoterminen DNA/RNA-monistus, joka todella toimii. . Haettu 9. syyskuuta 2017. Arkistoitu alkuperäisestä 9. syyskuuta 2017. (määrätön)
19. ↑ Englanninkielinen video: Mikä on rekombinaasipolymeraasin monistus? — TwistDx arkistoitu 24. marraskuuta 2016 Wayback Machinessa
20. ↑ Pierce KE ja Wangh LJ Lineaarinen eksponentiaalisen polymeraasiketjureaktio ja siihen liittyvät teknologiat Reaaliaikaiset havaitsemisstrategiat nopeaan ja luotettavaan diagnoosiin yksittäisistä soluista  //  Methods Mol Med. : päiväkirja. - 2007. - Voi. Methods in Molecular Medicine™ . - s. 65-85 . — ISBN 978-1-58829-578-1 . - doi : 10.1007/978-1-59745-298-4_7 . — PMID 17876077 .
21. ↑ Fluoresenssi SpectraViewer Fluoresenssi SpectraViewer | Life Technologies . Käyttöpäivä: 30. lokakuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 15. marraskuuta 2012. (määrätön)
22. ↑ Romanov MN, Ellegren H., Dodgson JB (13.1.2001). Polymeraasiketjureaktiolla vahvistetut markkerit lintujen sukupuolen määrittämiseen . Kansainvälinen kasvi- ja eläingenomi IX -konferenssi (San Diego, 13.–17. tammikuuta 2001) . San Diego, CA, USA: Scherago International. s. 118.OCLC 899128222.  _ _ Tiivistelmä P229. Arkistoitu alkuperäisestä 2020-09-20 . Haettu 26.10.2020 . Käytöstä poistettu parametri |deadlink=( ohje ) (Englanti)

Kirjallisuus

• Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Periaatteet ja soveltaminen. Per. englannista. - M .: Mir, 2002. - 589 s., ill. — ISBN 5-03-003328-9
• Patrushev L. I. Keinotekoiset geneettiset järjestelmät. - M .: Nauka, 2005. - 2 osaa - ISBN 5-02-033278-X
• Shchelkunov S. N. Geenitekniikka. - Novosibirsk: Sib. univ. kustantamo, 2004. - 496 s.; sairas. — ISBN 5-94087-098-8
• Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. Oligonukleotidien sulamislämpötilat PCR-olosuhteissa: Mg 2+ :n, deoksinukleotiditrifosfaatin ja dimetyylisulfoksidin pitoisuuksien lähin naapurikorjaukset vertaamalla vaihtoehtoisia empiirisiä kaavoja 0 syyskuuta1, Archi2 Syyskuu 1, Archi2 Syyskuu 1:ssä . Clin Chem , 47:1956-1961.
• Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. Java-verkkotyökalut PCR:lle, in silico PCR:lle ja oligonukleotidien kokoonpanolle ja analyysille . Genomics, 98(2): 137-144. http://primerdigital.com/tools/ Arkistoitu alkuperäisestä 16. syyskuuta 2012.

Linkit

• PCR-laboratorion toiminta. Patogeenisyysryhmien I-II mikro-organismeilla infektoituneen materiaalin PCR-tutkimusten työn organisointi. Arkistokopio päivätty 29. syyskuuta 2010 Wayback Machinessa .
• Sivusto "Classical and Molecular Biology": PCR:ään liittyvät tekniikat Arkistoitu 8. kesäkuuta 2007 Wayback Machinessa

Sanakirjat ja tietosanakirjat	Suuri tanskalainen iso kiinalainen iso kiinalainen iso kiinalainen Iso venäläinen maailman ympäri Britannica (verkossa) Brockhaus Universalis Universalis
Bibliografisissa luetteloissa	BNF : 121493620 GND : 4256726-9 J9U : 987007546303405171 LCCN : sh89002539 NKC : ph907888