Triplex-DNA , H-DNA tai tripleksi-DNA on DNA:n muoto , jossa kolme oligonukleotidiä kietoutuu toistensa ympärille muodostaen kolmoiskierteen. Kolmijuosteisessa DNA:ssa kolmas DNA-juoste sitoutuu DNA:n kaksijuosteiseen B-muotoon, joka muodostuu Watson-Crick- vuorovaikutuksista, Hoogsteen - vuorovaikutuksista tai käänteisistä Hoogsteen - vetysidoksista . Kolmijuosteinen DNA voi häiritä normaalia replikaatiota ja lisätä mutaatioiden tiheyttä muodostumisalueella.
Tripleksiä muodostavat oligonukleotidit (TFO:t) ovat 15–25 nukleotidin pituisia oligonukleotideja , jotka sitoutuvat kaksijuosteisen DNA:n pääuraan muodostaen molekyylien välistä tripleksi-DNA:ta. TFO:t voivat suppressoida transkriptiota sitoutumalla DNA:n kaksoiskierteeseen, koska tässä tapauksessa transkriptiotekijöiden sitoutumiskohdat ovat saavuttamattomissa. TFO:n viemistä soluun voidaan käyttää ohjaamaan geenin ilmentymistä, kohdennettua mutageneesiä , ja siitä voi tulevaisuudessa tulla yksi geeniterapiastrategioista .
Tymiini (T) voi olla vuorovaikutuksessa Watson - Crick -parin T - A kanssa Hoogsteenin vetysidoksen kautta. Tymiini muodostaa vetysidoksia adeniinin kanssa alkuperäisessä T-A-parissa muodostaen T-A*T-tripletin [1] . Happamassa ympäristössä protonoitu sytosiini (C+) voi myös olla vuorovaikutuksessa C - G -parin kanssa Hoogsteen-vuorovaikutusten kautta, jolloin muodostuu C-G*C+-tripletti. T-A*T ja C-G*C+ tripletit ovat stabiileimpia mahdollisia triplettejä, kun taas T-A*G ja C-G*G tripletit ovat vähiten stabiileja [2] .
Kolmijuosteista DNA:ta on kaksi luokkaa: molekyylinsisäinen ja molekyylien välinen. Kun kyseessä on molekyylien välinen tripleksi-DNA, DNA-dupleksin ja toisen ulkoisen DNA-juosteen välille muodostuu sidos, joka voi olla joko homologisesta kromosomista tai olla tripleksiä muodostava oligonukleotidi (TFO ) . Molekyylisisäinen kolmijuosteinen DNA muodostuu dupleksesta, jossa on homopuriini- ja homopyrimidiinialueita , joilla on toistuva peilisymmetria [3] . Muodostuneen molekyylinsisäisen kolmijuosteisen DNA:n määrään vaikuttaa DNA:n superkiertymisaste [4] . Molekyylisisäistä tripleksi-DNA:ta on kahta tyyppiä: H-DNA ja H*-DNA. H-DNA muodostuu happamassa ympäristössä kaksiarvoisten kationien , kuten Mg2 + :n, läsnä ollessa . Tässä konformaatiossa dupleksissa oleva homopyrimidiiniketju kääntyy takaisin sitoutuakseen rinnakkain puriiniketjun kanssa. Tämän konformaation stabiloivat kantakolmikot T—A*T ja C—G*A+. Viimeisen kolmikon tapauksessa sytosiini on protonoitava, minkä vuoksi H-DNA:n muodostumiseen tarvitaan hapan ympäristö [5] . H*-DNA muodostuu neutraaleissa pH-arvoissa kaksiarvoisten kationien läsnä ollessa. H*-DNA:n tapauksessa homopyrimidiini- ja puriiniketjut sitoutuvat toisiinsa antirinnakkaisella tavalla. H*-DNA:ta stabiloivat triadit T—A*A ja C—G*G [3] [5] .
Tripleksiä muodostavat oligonukleotidit (TFO:t) ovat 15–25 nukleotidin pituisia oligonukleotideja , jotka sitoutuvat kaksijuosteisen DNA:n pääuraan muodostaen molekyylien välistä tripleksi-DNA:ta. On saatu useita todisteita siitä, että in vivo nämä oligonukleotidit voivat osallistua geeniekspression säätelyyn [6] .
TFO:illa on taipumus sitoutua homopuriini- tai homopyrimidiinikohtiin, joita löytyy useimmiten geenien promoottorien ja intronien alueelta [7] . TFO:t voivat suppressoida transkriptiota sitoutumalla DNA:n kaksoiskierteeseen, koska tässä tapauksessa transkriptiotekijöiden sitoutumiskohdat ovat saavuttamattomissa. TFO:n viemistä soluun transfektiolla tai muilla menetelmillä voidaan käyttää geenin ilmentymisen [8] , kohdennetun mutageneesin säätelyyn , ja siitä voi tulevaisuudessa tulla yksi geeniterapiastrategioista . Esimerkiksi vuonna 2004 luotiin TFO, joka sitoo spesifisesti transkriptiotekijää ETS2 koodaavan geenin promoottorin, jonka yli-ilmentymistä havaitaan usein eturauhassyövässä [9] . TFO on kehitetty, joka on spesifisesti vuorovaikutuksessa apoptoosin repressoriproteiinia koodaavan bcl-2- geenin promoottorin kanssa [10] .
Kolmijuosteisen DNA:n muodostumisen seurauksena tapahtuva transkription suppressio voi olla ihmisten sairauksien ja patologisten tilojen taustalla. Siten Friedreichin ataksiassa H-DNA:n muodostuminen estää FXN -geenin intronin 1 ilmentymisen [11] . Viime kädessä tämä johtaa hermostoa rappeutuvien prosessien käynnistymiseen hermostossa ja liikehäiriöihin raajoissa [12] . Tripleksi-DNA:n muodostuminen voidaan tunnistaa nukleotidileikkauskorjausjärjestelmästä , joka korjaa kaksijuosteisen DNA:n rakenteen [13] .
Synteettiset peptidonukleiinihapot (PNA) voivat myös olla vuorovaikutuksessa dupleksi-DNA :n kanssa, jossa sokerifosfaattirunko on korvattu pseudopeptidirungolla . Kun peptidonukleiinihappo sitoutuu dupleksi-DNA:han, yksi DNA-juosteista siirtyy ja muodostuu P-silmukka. Peptidonukleiinihapot ovat resistenttejä proteaaseille ja niitä voidaan käyttää korjaamaan kohdelokuksessa H -DNA:n muodostumisen vuoksi. PNA:t voivat sitoutua DNA:n komplementaariseen juosteeseen suurella affiniteetilla ja spesifisyydellä Watson-Crick-vuorovaikutusten kautta. Tripleksi-DNA:n muodostumisen aikana PNA on vuorovaikutuksessa dupleksin kanssa Hoogsteen-vuorovaikutusten kautta [14] . Toisin kuin todellinen triplex-DNA, PNA:n ja kaksijuosteisen DNA:n hybridi on stabiili, koska PNA ei sisällä negatiivisesti varautunutta sokerifosfaattirunkoa, vaan neutraalin pseudopeptidirungon [15] . Toisin kuin TFO:t, jotka sitoutuvat dupleksi-DNA:han suuren uran alueella, PNA:t ovat vuorovaikutuksessa DNA:n kaksoiskierteen kanssa eri tavoin [14] .
Sekakoostumuksen sisältävä dupleksi-DNA-sekvenssi voidaan tunnistaa pseudokomplementaaristen PNA-molekyylien parista, jotka voivat kaksinkertaisesti tunkeutua DNA-heliksiin johtuen diaminopuriinin (D) ja tiourasiilin ( US ) samanaikaisesta muodostumisesta , mikä korvaa adeniinin ja tymiinin [16] . Pseudokomplementaariset PNA:t muodostavat PNA:DNA-koostumuksen heliksejä kunkin dupleksisäikeen kanssa johtuen D-T-, US -A-, G-C- ja C-G-parien muodostumisesta. Toinen dupleksiinvaasion muoto voidaan suorittaa homopuriini-PNA:lla, mikä johtuu komplementaarisesta vuorovaikutuksesta antiparalleelisen DNA-juosteen kanssa [17] [15] .
Lopuksi PNA : t voivat muodostaa "puristimen" kohdekohtaan kemiallisen modifikoinnin seurauksena. Yksi "puristin"-tyyppi sisältää kahden PNA:n rakenteen, jotka on yhdistetty joustavalla linkkerillä - 8-amino-3,6-dioksaoktaanihapolla [18] . Tämä rakenne muodostaa PNA:DNA:PNA-tripleksin kohdekohdassa, jolloin yksi PNA:ista on vuorovaikutuksessa antirinnakkais-DNA-juosteen kanssa käyttäen Watson-Crick-pareja, kun taas toinen juoste muodostaa Hoogsteen-pareja toisen juosteen kanssa, toisen juosteen täytyy välttämättä sisältää homopuriini- tai homopyrimidiinikohta, jonka kanssa PNA on vuorovaikutuksessa [17] . Toinen "puristimen" muoto tunnetaan nimellä " häntäpuristin " . Se koostuu PNA:DNA:PNA-puristimesta ja ylimääräisestä DNA:PNA-dupleksista, joka muodostaa 5–10 bp:n hännän . Tässä tapauksessa alkuperäisessä DNA-dupleksissa ei tarvita homopuriini- tai homopyrimidiinikohtaa [15] .
Sellaisen epästabiilin rakenteen kuin H-DNA:n muodostuminen voi aiheuttaa genomisen epävakauden sen esiintymiskohdassa [19] . Esimerkiksi c-MYC-geenin P1-promoottorin vieressä on polypuriinialueita , jotka kykenevät muodostamaan tripleksi-DNA:ta, ja sen muodostuminen johtaa epästabiilisuuden lisääntymiseen lähellä c-MYC :tä . Kokeet siirtogeenisillä hiirillä osoittivat, että triplex-tilaan siirtymiseen alttiiden ihmisen sekvenssien vieminen yhdessä Z-DNA :han siirtyvien sekvenssien kanssa genomin alueille, joiden geneettistä epävakautta ei ole tiedossa, johtaa epävakauden ilmenemiseen. niissä [20] . Lisäksi tiedetään, että H-DNA:n muodostuminen voi edistää kromosomien 14 ja 18 välisiä translokaatioita , jotka ovat monien syöpien , kuten follikulaarisen lymfooman , taustalla . Tutkijat ovat osoittaneet, että H-DNA:n muodostumisen todennäköisyyden vähentäminen vähentää myös translokaatioiden todennäköisyyttä [20] [21] .
Kolmijuosteinen DNA voi häiritä normaalia replikaatiota ja, kuten muut ei-kanoniset DNA-rakenteet, lisätä mutaatioiden tiheyttä muodostumisalueella [22] . Kuten edellä mainittiin, H-DNA voi muodostaa fyysisen esteen transkriptiolle. Kuten kokeet T7-RNA-polymeraasilla osoittivat , transkriptiolaitteisto ei pystynyt voittamaan Watson-Crickin ja Hoogsteenin vuorovaikutuksia, jotka sitovat tripleksiketjuja, mikä johti transkription pysähtymiseen [23] . Transkription pysäyttäminen transkriptiokoneiston törmäyksessä H-DNA:n kanssa aktivoi transkriptiokytketyn korjauksen, jonka vuoksi H-DNA leikataan pois, mikä johtaa deleetioihin [24] .
Kolmijuosteinen DNA voidaan tunnistaa eri nukleaasien avulla . Esimerkiksi nukleaasit ERCC1-XPF ja ERCC1-XPG, jotka osallistuvat nukleotidien leikkauskorjaukseen, leikkaavat H-DNA:n silmukan alueelta, jonka muodostavat säikeet, jotka ovat vuorovaikutuksessa Hoogsteen-parien ja Watsonin muodostavan juosteen 5'-pään kautta. -Crick-parit [25] . Tämä aukko voi johtaa suuriin deleetioihin, jotka johtavat genomiseen epävakauteen. FEN1 nukleaasi päinvastoin estää genomisen epävakauden. Se, kuten ERCC1-XPG, tuo katkon H-DNA:han ketjun 5'-päähän, joka ei ole osallisena Hoogsteenin vuorovaikutuksessa. HeLa-soluissa , joista puuttuu FEN1 , deleetioiden määrä lähellä H-DNA:ta on suurempi kuin soluissa, joissa on FEN1, ja H-DNA:n mutageeninen vaikutus soluissa, joista puuttuu FEN1, oli voimakkain DNA:n replikaation aikana. Siten FEN1 estää H-DNA:n indusoimaa mutageneesiä replikaatiosta riippuvaisella tavalla [22] [25] .
Kuten edellä mainittiin, TFO voisi olla geeniterapiatyökalu. Suurin vaikeus TFO:n ja peptidonukleiinihappojen lääketieteellisessä käytössä on niiden kuljettaminen soluihin [26] . Vuonna 2013 osana tutkimusta, jonka tavoitteena oli muuttaa geenien ilmentymistä hematopoieettisissa soluissa , ehdotettiin peptidonukleiinihappomolekyylien silloittamista soluun tunkeutuvan peptidin (CPP sekä poly ( maito-ko-glysiinihapon) nanopartikkeleita. [27] . Tätä lähestymistapaa käyttämällä työn tekijät onnistuivat muuntamaan 6 emäsparia CCR5 -geenissä , joiden mutaatiot liittyvät HIV -resistenssiin [28] . CCP:t mahdollistavat pienten "lastien", kuten pienten biomolekyylien , vapaan kuljettamisen solujen sisään . Poly(maito-ko-glykoiinihappo) on biohajoava polymeeri , joka voi kapseloida peptidonukleiinihappomolekyylejä hiukkasiksi. Toisessa kystisen fibroosin hoitoa koskevassa tutkimuksessa käytettiin peptidonukleiinihappojen kuljettamista nanopartikkelien koostumuksessa kohdesoluihin . Peptidonukleiinihapot yhdessä DNA-luovuttajamolekyylin kanssa pakattiin nanopartikkeleihin ja kuljetettiin keuhkoputkien epiteelisoluihin CFTR -geenin mutaation muokkaamiseksi [29] .
1950-luvulla, kun DNA:n tarkkaa rakennetta ei tiedetty, kolmijuosteista heliksiä pidettiin yhtenä mahdollisista malleista DNA:n järjestäytymiselle solussa. Linus Pauling ja Robert Corey [ pitivät DNA:n kolmijuosteista rakennetta todennäköisimpänä, jotka esittelivät kolmijuosteisen DNA-mallin vuonna 1953 [ 30] [31] . Watson ja Crick, jotka myöhemmin saivat Nobelin kemian palkinnon DNA:n rakenteen määrittämisestä, taipuivat myös aluksi kolmijuosteiseen malliin, mutta he näkivät siinä useita ongelmia, jotka eivät olleet yhteensopivia tuolloin saatavilla olevien kokeellisten tietojen kanssa. . Erityisesti kierteen akselia päin olevat negatiivisesti varautuneet fosfaatit hylkivät toisiaan sähköstaattisista syistä, mikä tekisi mahdottomaksi stabiilin kolmoiskierteen olemassaolon. Paulingin ja Koreyn kolminauhaisessa mallissa jotkin van der Waalsin etäisyydet olivat liian pieniä. R. Fraser ehdotti myös malliaan kolmoiskierteestä, jossa fosfaatit sijaitsivat kierteen pinnalla ja typpipitoiset emäkset kääntyivät sisäänpäin, mutta sitä ei tuettu kokeellisilla tiedoilla [ 32] .
Vaihtoehtoista kolmijuosteista DNA-rakennetta ehdotettiin vuonna 1957 [33] . J. Fensenfeld, D. R. Davis ja A. Rich ennustivat, että stabiili kolmijuosteinen DNA voi muodostua, jos yksi juoste koostuisi vain puriininukleotideista ja kaksi muuta vain pyrimidiinejä [6] [33] . Uskottiin, että in vivo tällainen rakenne muodostuu vain RecA -proteiinin toiminnan välituotteena Escherichia coli -bakteerissa tapahtuvan rekombinaation aikana . 1960-luvulla ehdotetut kolmijuosteiset DNA-mallit ennustivat ei Watson-Crick-, vaan Hoogsteen-parien muodostumista DNA-suururassa [6] . Jonkin aikaa myöhemmin ehdotettiin kolmijuosteista DNA-mallia, joka koostui yhdestä pyrimidiini- ja kahdesta puriiniketjusta [6] . Kolmijuosteisen DNA:n löytäminen elävistä soluista 1980-luvun lopulla osana superkierteisiä plasmideja osoitti, että H-DNA:n muodostuminen on periaatteessa mahdollista elävissä soluissa [34] . Lisäksi pian osoitettiin, että homopyrimidiini ja jotkut runsaasti puriinia sisältävät oligonukleotidit voivat sitoutua spesifisiin sekvensseihin dupleksi-DNA:ssa, mikä johtaa kolmijuosteisen DNA:n muodostumiseen [35] .