V(D)J-rekombinaatio [1] tai V(D)J-rearrangement [2] ( eng. V(D)J-recombination, V(D)J rearrangement ) on somaattisen DNA :n rekombinaatiomekanismi , joka tapahtuu lymfosyyttien erilaistumisen varhaiset vaiheet ja johtavat antigeeniä tunnistavien vasta -aineosien ja T-solureseptorin muodostumiseen . Immunoglobuliinien ( englanniksi Ig ) ja T-solureseptorien ( englanniksi TCR ) geenit koostuvat toistuvista segmenteistä, jotka kuuluvat kolmeen luokkaan: V ( englanniksi muuttujasta ), D ( englanniksi diversity ) ja J ( englanniksi .joining ) . V(D)J-uudelleenjärjestelyn aikana geenisegmentit, yksi kustakin luokasta, liitetään yhteen. V(D)J-segmenttien yhdistetty sekvenssi koodaa kunkin reseptori- tai vasta -aineketjun vaihtelevia domeeneja [2] .
Vasta- aine (immunoglobuliini) molekyyli on tetrameeri , jossa on kaksi identtistä raskasta (H-ketjua) ja kaksi identtistä kevyttä ketjua (L-ketju). Jokaisella ketjulla on N-terminaalinen vaihteleva alue (muuttuja tai V-domeeni) ja vakioalue (vakio tai C-domeeni) C-päässä . Vaihteleva domeeni osallistuu antigeenin tunnistamiseen , ja C-domeeni on vastuussa efektoritoiminnoista. Kuten nimestä voi päätellä, V-domeenin aminohapposekvenssi on vaihteleva, kun taas C-domeeni osoittaa voimakasta konservatiivisuutta . Suurin vaihtelu ilmenee juuri antigeenin sitoutumisesta vastaavalla alueella [3] . Antigeenia sitovan kohdan muodostavat raskaiden ja kevyiden ketjujen V-domeenit ( VH- ja VL - domeenit, vastaavasti) [4] . L-ketju sisältää yhden C-domeenin (merkitty CL: ksi ) ja H-ketju sisältää 3 tai 4 domeenia, joita merkitään CH 1, CH 2, CH 3, CH 4. C-domeenit eivät ole mukana antigeenin tunnistamisessa. ja ne ovat välttämättömiä vuorovaikutuksessa immuunisolureseptorien kanssa, komplementtijärjestelmän aktivoinnissa ja muissa efektoritoiminnoissa [5] .
Toisin kuin useimmat geenit, immunoglobuliini- ja T-solureseptorigeenit eivät ole kokonaisuutena läsnä ituradassa ja somaattisissa soluissa . Yhden V- ja C-domeeneja koodaavan geenin muodostuminen tapahtuu yhden (kevyiden ketjujen tapauksessa) tai kahden (raskasketjujen tapauksessa) somaattisen rekombinaation kautta. V-domeeneja ja C-domeeneja koodaavat V-geenin ja C-geenin erilliset segmentit, vastaavasti, eikä niitä voida ilmentää yksinään: tässä järjestelmässä kaksi "geeniä" koodaa yhtä polypeptidiä - kevyttä tai raskasta. ketju. Mikä tahansa useista V-geenisegmenteistä voi liittyä mihin tahansa useista C-geenisegmenteistä. Kevytketjut muodostuvat yhden rekombinaation tuloksena. Kevyitä ketjuja on kahta tyyppiä: κ ja λ. λ - kevyt ketju muodostuu rekombinaatiolla Vλ -geenin ja JλCλ -segmentin välillä . Kirjain J on lyhennetty paikaksi, johon V λ -segmentti on kytketty , eli kytkentäreaktio ei tapahdu suoraan V λ - ja C λ -segmenttien välillä, vaan J λ -segmentin kautta . Tämä segmentti koodaa useita vaihtelevan alueen aminohappotähteitä (a.o.), ja rekombinaation avulla muodostuneessa geenissä VX -JX- segmentti on yksi eksoni , joka koodaa koko vaihtelevaa aluetta. κ-tyypin kevytketjun tapauksessa ketju kootaan myös kahdesta segmentistä, mutta Vk -geenin jälkeen seuraa viiden segmentin ryhmä J κ , jonka erottaa eksonista Ck intronilla 2. 3 tuhatta emäsparia pitkä . Rekombinaation aikana Vk - segmentti voi liittyä minkä tahansa JK- segmentin kanssa, ja ehjä muuttuva eksoni koostuu lopulta Vk- ja Jk - segmenteistä . J κ -segmentit, jotka sijaitsevat rekombinoituvan J κ -segmentin vasemmalla puolella, poistetaan ja J κ -segmentit rekombinoituvan segmentin oikealla puolella tulevat osaksi muuttujan ja vakion eksonien välistä intronia [6] .
Raskaat ketjut muodostuvat ei yhden, vaan kahden rekombinaatiotapahtuman seurauksena, ja niiden muodostumiseen osallistuvat elementit, kuten VH -geeni, D-segmentti ja VH CH - geenisegmentti. D-segmentti on 2-13 a. o., erottamalla VH - segmenttiä ja JH -segmenttiä koodaavat sekvenssit . D-segmenttien paikka kromosomissa sijaitsee myös V H -segmenttien ja J H -segmenttien joukkojen välissä. V H -DJ H -yhdistelmä tapahtuu kahdessa vaiheessa: ensin yksi D-segmenteistä liitetään J H -segmentteihin ja sitten V H -segmentti yhdistyy yhdistettyyn DJ H -segmenttiin . Tuloksena oleva kolmen VH - DJH - elementin sekvenssi ilmentyy yhdessä CH-geenin kanssa , joka sijaitsee VH - DJH :n oikealla puolella ja sisältää neljä eksonia. Ihmisillä D-segmentin lokus sisältää 30 D-segmenttiä peräkkäin , jota seuraa 6 JH -segmentin klusteri . Vielä ei tiedetä, kuinka varmistetaan , että sama D-segmentti osallistuu DJ H- ja VH - DJ H -rekombinaatiotapahtumiin . Yksittäisten elementtien nimen mukaan prosessia, jossa muodostetaan yksittäinen kevyttä tai raskasta ketjua koodaava lokus, kutsuttiin V(D)J-rekombinaatioksi [7] .
T -solureseptori ( TCR ) on heterodimeeri kahdesta alayksiköstä : α ja β (TCRαβ-reseptori) tai y ja δ (TCRγδ-reseptori), jotka koodaavat TCRA-, TCRB-, TCRG- ja TCRD-geenejä, vastaavasti. Vaikka TCR 8-ketjua koodaavat sekvenssit sijaitsevat a-ketjugeenissä, niitä pidetään yleensä erillisenä geneettisenä klusterina . Kuten immunoglobuliinien tapauksessa, T-solureseptori sisältää vakiodomeeneja ja niitä koodaavia C-geenejä, V-geenejä koodaavia V-domeeneja ja J-segmenttejä, jotka erottavat C-geenien ja V-geenien klustereita (TCRB:ssä ja TCRD-geenejä on myös D-segmenttejä). Jokaisen neljän mahdollisen TCR-ketjun muodostumisen aikana tapahtuu myös V(D)J-rekombinaatio [8] . D-segmenttejä sisältävien TCRB- ja TRCD-geenien tapauksessa rekombinaatio tapahtuu kahdessa vaiheessa (ensin D- ja J-segmenttien välillä, sitten DJ- ja V-segmenttien välillä) ja TCRA- ja TRCG-geenien tapauksessa yhdessä vaiheessa [9] .
Siten vain seitsemän geenilokusta on alttiina V(D)J-uudelleenjärjestelylle: immunoglobuliinin (IgH) raskas ketju, kevyet ketjut κ ja λ sekä neljä T-solureseptorigeeniä, jotka koodaavat ketjuja α, β, γ, δ: TCRA, TCRB, TCRG ja TCRD. D-segmenttejä on vain immunoglobuliinin raskaan ketjun geenissä, TCRB:ssä ja TCRD:ssä [10] .
Kaikkien antigeenin tunnistamiseen osallistuvien polypeptidiketjujen V-geenit käyvät läpi uudelleenjärjestymisen, mutta ei samaan aikaan, vaan peräkkäin. B - soluissa raskasketjun geenit järjestyvät uudelleen ensin ja sitten kevytketjun geenit (K-tyypin kevyet ketjut järjestetään ensin uudelleen, sitten λ-tyypin kevyet ketjut). T-soluissa TCRαβ -geenien muodostumisen aikana β- ja sitten a-ketjugeenit järjestyvät ensin uudelleen. TCRγδ:n tapauksessa γ- ja δ-ketjujen vaihtelevien domeenien geenien uudelleenjärjestyminen tapahtuu lähes samanaikaisesti [11] .
V(D)J-rekombinaatio etenee loppuun vain T- ja B-soluissa ulkoisesta ympäristöstä tulevien erilaistumissignaalien vaikutuksesta. DJ-rekombinaation muodossa tapahtuvan uudelleenjärjestelyn alkuvaiheet voivat tapahtua myös soluissa , jotka eivät ole sukua T- ja B-soluille, esimerkiksi luonnollisissa tappajissa , jotka ovat alkuperältään lähellä T-soluja [12] . Immunoglobuliinien tai T-solureseptorien kaikkien seitsemän lokuksen V(D)J-rekombinaation molekyylimekanismi on identtinen [13] . V(D)J-rekombinaatioreaktioiden sekvenssi on kuvattu edellisessä osiossa, ja V(D)J-rekombinaation molekyylimekanismit kuvataan myös tässä.
Rekombinaatio tapahtuu DNA-signaalisekvensseissä, jotka ovat välittömästi geenisegmenttien vieressä. Näitä konservoituneita sekvenssejä kutsutaan rekombinaatiosignaalisekvensseiksi ( englanniksi rekombinaatiosignaalisekvenssi , RSS) ja ne koostuvat seitsemästä nukleotidista - 5'-CACAGTG-3' ( heptameeri ), jota seuraa 12 tai 23 nukleotidin sekvenssi - välike ja enemmän yksi konservatiivinen yhdeksän nukleotidin lohko - 5'-ACAAAAACC-3' (nonameer). Välikkeen sekvenssi voi vaihdella, mutta pituus on konservatiivinen ja vastaa yhtä (12 nukleotidia) tai kahta (23 nukleotidia) DNA- kaksoiskierteen kierrosta Uudelleenjärjestely tapahtuu vain kahden RSS:n välillä, joista toisessa on 12 emäsparin (bp) välike, toisessa 23 emäsparin välike, niin sanottu "12/23 rekombinaatiosääntö". Tämä RSS-rakenteen malli määrittää oikean rekombinaatiosekvenssin: esimerkiksi IGH-lokuksella on 23 bp RSS. kunkin V-segmentin 3'-päässä, RSS 12 bp pitkä. kunkin D-segmentin 3'- ja 5'-päissä ja 23 bp:n RSS. kunkin J-segmentin 5'-päässä. Siten tämän lokuksen VJ:n uudelleenjärjestely ei ole mahdollista. Konsensussekvenssien järjestely V- tai J-segmenteissä voi olla mikä tahansa, toisin sanoen eri spacerit toimivat vain estämään V- tai J-segmentin rekombinaation saman segmentin kanssa eivätkä sisällä merkittävää informaatiota [14] .
RAG1 ja RAG2 ( rekombinaatioaktivaatiogeenit ) -proteiinit ovat välttämättömiä ja riittäviä DNA-katkojen tuomiseen V(D)J-rekombinaation aikana . Hiirillä , joista puuttuu RAG1- ja RAG2- geenit, on vain epäkypsiä T- ja B-soluja, koska ne eivät pysty muodostamaan toimivia vasta-aineita ja T-solureseptoreita. RAG1 tunnistaa signaalisekvenssit vastaavilla 12 tai 23 bp välikkeillä. ja värvää RAG2:n reaktiokompleksiin. Signaalisekvenssi 9 p. on ensisijainen tunnistuspaikka ja 7 bp:n sekvenssi. osoittaa leikkauksen sijainnin. RAG1:n ja RAG2:n dimerisoitumisen seurauksena niihin liittyvät sekvenssit lähestyvät toisiaan, mitä helpottaa myös signaalisekvenssien väliset komplementaariset vuorovaikutukset, jotka ovat mahdollisia niiden palindromiteetin vuoksi . HMG1/2-heterodimeeri osallistuu myös RAG1:een ja RAG2:een liittyvien sekvenssien konvergenssiin. RAG1/2-kompleksi tuo yhden juosteen katkeamisen kummallekin alueelle, jotka yhdistetään rekombinaatiolla. Jokaisen kahden yksijuosteisen katkaisun päissä on 5'-pään fosfaattiryhmä ja 3'-pään hydroksyyliryhmä (3'-OH). Koodaavan segmentin vieressä oleva 3'-OH hyökkää -fosfodiesterisidokselle sopivassa kohdassa DNA-dupleksin toisella puolella. Tämän reaktion seurauksena jokaisen yksisäikeisen katkeamisen kohdalle muodostuu hiusneula , jossa toisen DNA-kierteen kahdesta juosteesta 3'-pää on kytketty kovalenttisesti 5'-päähän. duplexin toinen säie. Ku70- ja Ku80 -proteiinien heterodimeeri tunnistaa koodaavien segmenttien päissä olevat hiusneulat , ja Artemis -proteiini avaa hiusneulat. Lisäksi koodaavien segmenttien päät yhdistetään samalla mekanismilla kuin päiden ei-homologisessa yhteydessä DNA-korjauksen aikana . Jos DNA-ketjun katkeaminen tapahtuu lähellä hiusneulaa, muodostuu pitkä yksijuosteinen alue koodaavan segmentin loppuun. Seuraavaksi valmistuu sille komplementaarinen ketju ja koodaavan segmentin pään alueelle viedään useita ylimääräisiä nukleotideja, jotka muodostavat sekvenssin, joka on palindrominen alkuperäiseen nähden (siksi niitä kutsutaan englannin kielestä P-nukleotideiksi palindromi ). Lisää nukleotideja koodaavien segmenttien välillä voi myös tulla toisesta prosessista. Entsyymi terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) tuo pienen määrän (jopa 20, tavallisesti alle 10) ylimääräisiä satunnaisia nukleotideja (N-nukleotideja) segmenttien päiden väliin, minkä jälkeen ne ligoidaan ei-homologiseen päiden yhdistämisreittiin. [15] . RSS-signaalisekvenssit sisältävä leikkausosa sulkeutuu muodostaen renkaan muotoisen rakenteen, joka tunnetaan nimellä rekombinaatioleikkausympyrä (REC englanniksi. Recombination excision circle ) [9] .
Koodaavien segmenttien päiden yhdistäminen tapahtuu ei-homologisen pään yhdistämisen mekanismilla, johon osallistuvat entsyymit DNA ligaasi IV, DNA-riippuvainen proteiinikinaasi , proteiinit Ku70/Ku80, XRCC4 ja ei- homologinen pääteliitostekijä 1 [16] . Tämä päättää immunoglobuliiniketjua tai TCR:ää koodaavan geenin kokoamisen. DNA-riippuvainen proteiinikinaasi osallistuu Artemis-hiusneulaa erottavan proteiinin aktivaatioon fosforylaation kautta [17] . Proteiinien RAG1, RAG2, DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin, DNA-ligaasi IV:n, TdT:n, HMG1/2:n ja Ku70/Ku80:n yhdistelmää kutsutaan V(D)J-rekombinaatiokompleksiksi [18] .
V(D)J-rekombinaation ansiosta selkärankaisen kehossa syntyy valtava määrä vasta-aineita . Yksi raskaan ketjun lokus yksinään voi saada aikaan yli 108 erilaista VH -JH- CH : n yhdistelmää . Kevytketjulokukset voivat synnyttää noin miljoona rekombinoitua λ- tai κ-tyyppistä ketjua [19] . Vuonna 2008 George Church ehdotti koko veren vasta-aineiden kirjoa kutsumaan termiä V(D)J-th [20] .
Joissakin tapauksissa V(D)J-rekombinaatio voi johtaa inversioihin tai deleetioihin . Joten joskus λ-tyyppisten kevyiden ketjujen lokuksissa V λ -segmentin suuntaus kromosomissa on päinvastainen kuin J λ -C λ -lokuksen orientaatio , ja katkeaminen ja yhdistäminen johtaa tässä tapauksessa deletoidun kohdan kääntäminen signaalisekvensseillä sen sijaan, että se leikattaisiin pois kromosomista (deleetio). Inversion toiminnalliset seuraukset immuunijärjestelmään eivät eroa deleetion seurauksista. Rekombinaatio inversion kautta tapahtuu TCR-lokuksissa, raskasketjuissa ja κ-tyypin kevyissä ketjuissa [21] .
Kun tietyn V-geenin uudelleenjärjestely onnistuu, RAG -geenien ilmentyminen pysähtyy ja homologisessa kromosomissa oleva geeni pysyy järjestäytymättömänä eikä toimi. Noin kaksi kolmasosaa epäonnistuneista V(D)J-rekombinaatiotapahtumista johtuu kehyssiirrosta . Jos uudelleenjärjestely epäonnistuu, V(D)J-rekombinaatio alkaa homologisessa kromosomissa, ja jos se onnistuu, homologisessa kromosomissa oleva geeni jää ainoaksi toimivaksi, eli alleelinen poissulkeminen tapahtuu . 45 %:ssa tapauksista V(D)J-rekombinaatio epäonnistuu lymfosyytin molemmissa kromosomeissa ja se kuolee apoptoosin seurauksena . αβ-TCR:n tapauksessa, kun a-ketjun geenin uudelleenjärjestely epäonnistuu, muokkausprosessi käynnistyy uudelleen ja RAG -geeni ekspressoituu uudelleen. Rekombinaatio jatkuu Vα-segmentin osallistuessa, jota ei leikattu pois kromosomista ja joka ei päässyt leikkausrenkaaseen. Prosessi voidaan toistaa, kunnes kevyttä ketjua koodaava toiminnallinen geeni syntyy. Raskauden aikana tai kun T-solu tunnistaa oman antigeenin , α-ketjugeenin muokkaus voi tapahtua . Jos editoidaan α-ketjugeeniä, joka on ituradan konfiguraatiossa homologiparin toisessa kromosomissa, voi syntyä tilanne, joka rikkoo alleelin poissulkemissääntöä: yhdessä T-solussa on kaksi TCR:ää, joilla on sama. β-ketjuja, mutta erilaisia α-ketjuja [22] .
V(D)J-rekombinaation rikkomukset johtavat immuunikatotilojen kehittymiseen . Vakavassa yhdistelmäimmuunikatooireyhtymässä V(D)J-rekombinaation taso immunoglobuliineja ja T-solureseptoreita koodaavissa lokuksissa on hyvin alhainen. Vaikea yhdistetty immuunikato-oireyhtymä johtuu mutaatioista , jotka tekevät ei-toiminnallisia V(D)J-rekombinaatioproteiineja: RAG1, RAG2, Artemis tai DNA-riippuvainen proteiinikinaasi [23] [17] .
Dreyer ja Bennett ehdottivat vuonna 1965, että kaksi geeniä, V ja C, osallistuvat yksittäisen immunoglobuliinin raskaan tai kevyen ketjun rakentamiseen [24] . Vuonna 1976 Suzumi Tonegawa aloitti sarjan kokeita ja osoitti, että vasta-aineita koodaavat geenit käyvät läpi uudelleenjärjestelyjä, jotka luovat valtavan valikoiman vasta-aineita [25] . Vuonna 1987 Tonegawa sai Nobelin fysiologian tai lääketieteen palkinnon vasta-aineiden monimuotoisuuden mekanismien löytämisestä [26] .
| Lymfosyyttien adaptiivinen immuunijärjestelmä ja komplementti | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Lymfaattinen |
| ||||||||
| Lymfosyytit | |||||||||
| Aineet |
| ||||||||