Oligonukleotidien synteesi

Oligonukleotidien synteesi  on suhteellisen lyhyiden nukleiinihappofragmenttien kemiallista synteesiä, joilla on tietty kemiallinen rakenne (sekvenssi). Menetelmää käytetään nykyaikaisessa laboratoriokäytännössä halutun sekvenssin mukaisten oligonukleotidien saamiseksi nopeasti ja edullisesti.

Yleisin menetelmä oligonukleotidien synteesiä varten perustuu amidofosfiittien käyttöön. Ne  ovat rakennuspalikoita, jotka ovat deoksiribonukleosidien ( dA , dC , dG , T ) tai ribonukleosidien ( A , C , G , U ) reaktiivisia johdannaisia ​​ja mahdollistavat niiden synteesin. lyhyet DNA - ja RNA - fragmentit . Käytetään myös muita amidofosfiitteja, jotka mahdollistavat muunnettujen nukleosidien, erilaisten leimojen ja funktionaalisten ryhmien tuomisen tuoteketjuun . Synteesin aikana nämä reagenssit lisätään vuorotellen kohdetuotteen sekvenssin määräämässä järjestyksessä kiinteän faasin alustalla kasvavaan ketjuun . Tämä prosessi oli täysin automatisoitu 1970-luvun lopulla, ja se suoritetaan tällä hetkellä tietokoneohjatuissa syntetisaattoreissa.

Synteesin päätyttyä oligonukleotidi erotetaan kantajasta, synteesin aikana käytetyt suojaryhmät poistetaan ja saatu tuote puhdistetaan elektroforeesilla tai HPLC :llä .

Synteettisiä oligonukleotideja käytetään laajalti molekyylibiologiassa ja lääketieteessä, esimerkiksi antisense - oligonukleotideina, alukkeina DNA- sekvensointiin ja -amplifiointiin , koettimina komplementaaristen DNA- ja RNA-sekvenssien määrittämiseen , työkaluina mutaatioiden ja restriktiokohtien kohdistettuun tuomiseen ja synteesiin. keinotekoisia geenejä .

Historia

Oligonukleotidisynteesin evoluution aikana on kehitetty neljä päämenetelmää sidosten luomiseksi nukleosidien välille . Näitä menetelmiä käsitellään yksityiskohtaisesti yksityiskohtaisissa kirjallisuuskatsauksissa [1] [2] [3] .

Varhainen työ ja moderni H-fosfonaattimenetelmä

1950-luvun alussa Alexander Toddin ryhmä Cambridgesta loi perustan H-fosfonaatti- ja fosfotriesterimenetelmille oligonukleotidien synteesiä varten [4] [5] syntetisoimalla suojattua kloorifosfaattia 4 ja saattamalla sen reagoimaan 3'-suojatun tymidiinin 5 kanssa . saadun suojatun dinukleotidin 6 rakenteen vahvistaminen entsymaattisella katkaisulla. Kummallista kyllä, Cambridgessa ei tehty enempää työtä tähän suuntaan (Todd totesi omaelämäkerrassaan, että oligonukleotidien synteesi ei houkutellut häntä) [1] .

Paluu Toddin työhön tuli vasta 30 vuotta myöhemmin, kun kaksi tutkimusryhmää sovelsi H-fosfonaattikondensaatiota kiinteäfaasisynteesiin käyttämällä nukleosidi -H-fosfonaatteja rakennuspalikkaina ja pivaloyylikloridia , 2,4,6-tri-isopropyylibentseenisulfonyylikloridia (TIPS- Cl) ja muut yhdisteet - aktivaattoreina [6] [7] . Käytännössä menetelmä organisoitiin yksinkertaiseksi synteettiseksi sykliksi, jossa oli kaksi vaihetta: dimetoksitrityylisuojan poisto ja kondensaatio.

Nukleosidien välisen H-fosfonaattidiesterisidoksen hapetus tässä menetelmässä suoritetaan oligonukleotidiketjun synteesin jälkeen pyridiinin vesiliuoksen vaikutuksesta . Tarvittaessa hapetus voidaan suorittaa vedettömässä ympäristössä [8] . Menetelmä mahdollistaa myös oligonukleotidien tiofosfaatti [9] ja selenofosfaatti [10] analogien syntetisoinnin. Hapetus hiilitetrakloridilla primääristen ja sekundaaristen amiinien läsnä ollessa johtaa amidofosfaattianalogeihin [11] [12] .

Pääsääntöisesti 5'-hydroksyyliryhmä kaikissa nukleosidien 3'-H-fosfonaateissa ja aminoryhmä nukleosidien H-fosfonaateissa, joissa on emäkset A, G ja C, suojataan ennen käyttöä synteesissä samoilla ryhmillä kuin amidofosfiittimenetelmässä . Aminoryhmien suojaaminen ei kuitenkaan ole ehdottoman välttämätöntä [8] [13] .

Fosfodiesterimenetelmä

1950-luvulla Har Gobind Korana ja työtoverit kehittivät fosfodiesterimenetelmän, jossa 3' - O -asetyylinukleosidi-5'- O - fosfaatti aktivoitiin N , N'- disykloheksyylikarbodi- imidillä (DCC) tai p -tolueenisulfonyylikloridilla ( TsCl ) ja sitten injektoidaan reaktiossa 5' - O -suojatun nukleosidin kanssa dinukleosidimonofosfaatin muodostamiseksi [14] . Sen jälkeen kun suojaava asetyyliryhmä oli poistettu perusväliaineesta, suoritettiin ketjun lisäpidennys. Tri- ja tetrameerioligonukleotidien sarjat syntetisoitiin vaiheittaisella kondensaatiolla. Lisäksi suoritettiin oligomeeristen fragmenttien kondensaatio pidempien oligonukleotidien saamiseksi [1] .

Fosfaattiryhmien suojausta fosfodiesterisynteesissä ei käytetty, mikä ilmeisesti johti sivureaktioihin ja pienensi synteesin saantoa. Korana kuitenkin uskoi, että suojauksen asettaminen fosfaattiryhmille johtaisi oligonukleotidien pääedun – niiden polyelektrolyyttiluonteen – menettämiseen , jota hänen mielestään voitaisiin käyttää tehokkaasti oligonukleotidien puhdistamiseen. Tärkeä Koraanin löytö oli trityylisuojaryhmien käyttö 5'-hydroksyylinukleosidien suojaamiseksi [1] .

Fosfotrieterimenetelmä

1960-luvulla ryhmät, joita johtivat R. Letsinger ( eng.  R. Letsinger ) [15] [16] ja K. Reese ( eng.  C. Reese ) [17] kehittivät fosfotriesterimenetelmän. Ratkaiseva ero fosfodiesterilähestymistapaan on lähtöaineen ja tuotteen fosfaatin alustava suojaus syanoetyyliryhmällä -CH2CH2CN . Tämä muutos eliminoi oligonukleotidien haaroittumisen mahdollisuuden fosfaattiryhmissä. Menetelmän suurempi selektiivisyys mahdollisti reaktiivisempien kondensointireagenssien ja katalyyttien käytön [18] [19] , mikä lyhensi merkittävästi synteesin kestoa. Fosfotriesterimenetelmää toteutettiin sekä liuoksessa että kiinteässä faasissa [1] .

Tällä menetelmällä oli mahdollista syntetisoida kaksi kaksijuosteista 77 ja 104 emäsparin pituista oligonukleotidiä, joiden sekvenssi vastasi insuliinin A- ja B-ketjuja , mikä mahdollisti myöhemmin näiden geenien onnistuneen ilmentämisen [1] .

Fosfiittitriesterimenetelmä

1970-luvulla otettiin käyttöön nukleosidisten välisten sidosten muodostamiseen tarkoitettu fosfiittitriesterimenetelmä, jossa käytettiin paljon reaktiivisempia P(III-pohjaisia) nukleosidijohdannaisia, alun perin kloorifosfiitteja [20] . Myöhemmin M. Caruthersin johtama ryhmä käytti vähemmän aggressiivisia ja selektiivisempiä 1 H -tetratsolidifosfiitteja ja toteutti menetelmän kiinteän faasin versiossa [21] . Pian tämän jälkeen saman ryhmän työntekijät paransivat menetelmää käyttämällä rakennuspalikkaina stabiilimpia nukleosidiamidofosfiitteja . Vähemmän käytännöllisen metyylifosfaattisuojaryhmän [22] [23] [24] korvaaminen sopivammalla 2-syanoetyyliryhmällä [25] tuotti nukleosidiamidofosfiittien variantin, joka on edelleen standardireagenssi oligonukleotidien synteesiä varten. Lukuisat lisäparannukset menetelmissä monomeerilohkojen syntetisoimiseksi, oligonukleotidisyntetisaattoreissa sekä kokoonpano- ja suojauksenpoistoprotokollassa ovat muuttaneet amidofosfiittilähestymistavan erittäin luotettavaksi ja tuottavaksi menetelmäksi synteettisten oligonukleotidien saamiseksi [26] .  

Synteesi amidofosfiittimenetelmällä

Rakennuspalikat

Nukleosidiamidofosfiitit

Vuonna 1976 Letsinger ja työtoverit havaitsivat, että kolmiarvoiset fosforiyhdisteet ovat paljon aktiivisempia reagensseja kuin vastaavat viidenarvoiset fosforijohdannaiset. P(III)-yhdisteiden rooli tuli ilmeiseksi sen jälkeen , kun M. Carruthers kehitti nukleosidien N,N - di-isopropyyliamidifosfiittijohdannaiset ( nukleosidiamidofosfiitit ) [1] [22] , joilla on edelleen amidin standardirakennuspalikoiden rooli. fosfiittisynteesimenetelmä nykyään. Ei-toivottujen sivureaktioiden estämiseksi amidofosfiittien funktionaaliset ryhmät on estettävä suojaryhmillä . Kun oligonukleotidiketjun kokoaminen on valmis, kaikki suojaryhmät poistetaan, mikä johtaa kohdeoligonukleotidiin. Alla on suojaryhmät, joita käytetään tavallisissa kaupallisesti saatavissa nukleosidiamidofosfiiteissa [27] :

  • Hydroksyyliryhmä 5'-asemassa on suojattu 4,4'-dimetoksitrityyli (DMT) suojaryhmällä, joka poistetaan happamissa olosuhteissa.
  • Tymiinissä ja urasiilissa , tymidiinin ja uridiinin typpipitoisissa emäksissä , ei ole eksosyklisiä aminoryhmiä, joten ne eivät tarvitse suojaryhmiä. Guaniinilla on alhainen emäksisyys eksosyklinen aminoryhmä , joten se ei sivureagoi amidofosfiittien kanssa kondensaatioreaktio-olosuhteissa. Kuitenkin amidofosfiittireagenssi, joka perustuu N2-suojaamattomaan 5'- O -DMT-2'-deoksiguanosiiniin, liukenee huonosti asetonitriiliin  , oligonukleotidien synteesissä yleisimmin käytettyyn liuottimeen. Päinvastoin, saman yhdisteen N2-suojatut johdannaiset ovat erittäin liukoisia asetonitriiliin, ja siksi niitä käytetään paljon laajemmin. Typpipitoiset emäkset adeniini ja sytosiini sisältävät aminoryhmiä, jotka voivat reagoida amidofosfiittien kanssa synteesin aikana, ja siksi nämä ryhmät on suojattava synteesiä varten normaaleissa olosuhteissa. Kuitenkin lisäämällä synteettiseen sykliin lisävaiheita on mahdollista saavuttaa suojaamattomien amidofosfiittien dA ja dC käyttö [28] . Typpipitoisissa emäksissä olevat suojaryhmät on säilytettävä koko synteesin ajan, joten käytetään ryhmiä, joiden reaktiivisuus on päinvastainen kuin 4,4'-dimetoksitrityyliryhmällä, joka poistetaan jokaisen syklin jälkeen. Kaksi yleisimmin käytettyä lähestymistapaa kuvataan alla.
    • Ensimmäisessä tavanomaisessa lähestymistavassa bentsoyylisuojausta (Bz) käytetään suojaamaan adeniinia ja sytosiinia , kun taas guaniinia suojaa isobutyryyliryhmä ( i Bu) [29] . Myöhemmin ehdotettiin asetyyliryhmää (Ac) suojaamaan sytosiinia , joka voidaan poistaa ammoniakilla tai ammoniakin ja metyyliamiinin seoksella [30] .
    • Toisessa, lievemmässä suojajärjestelmässä adeniini suojataan isobutyryyli- [31] - tai fenoksiasetyyli- (PAC) [32] -ryhmillä. Sytosiini sisältää asetyylisuojaryhmän [30] , kun taas guaniinia suojaavat 4-isopropyylifenoksiasetyyli ( i Pr-PAC) [33] tai dimetyyliformamidiini (dmf) [34] . Pehmeät suojaryhmät poistetaan helpommin kuin standardiryhmät, mutta näitä ryhmiä sisältävät amidofosfiitit ovat vähemmän stabiileja liuoksessa säilytettäessä.
  • Fosfiittiryhmä on suojattu 2-syaanietyyliryhmällä [25] . Fosfiittisuojauksen läsnäolo on pakollista amidofosfiitille ja vasta muodostuneelle fosfiittitriesteriryhmälle ennen kuin jälkimmäinen hapettuu fosfotriesteriksi. Samaan aikaan suojan läsnäolo jo kootun oligonukleotidifragmentin fosfaattiryhmissä ei ole välttämätön onnistuneille lisäkondensaatiosykleille [35] .
  • RNA - synteesissä käytetään rakennuspalikoita, joissa on "ylimääräinen" 2'-hydroksyyliryhmä, joka ei osallistu synteesiin. Se on suojattu tert - butyylidimetyylisilyyli (TBDMS) [36] [37] [38] tai tri-isopropyylisilyylioksimetyyli (TOM) [39] [40] ryhmällä. Molemmat ryhmät poistetaan fluoridi -ionin vaikutuksesta.
  • Fosfiittiryhmä sisältää myös di-isopropyyliamiiniryhmän ( i - Pr2N ), joka on reaktiivinen happamissa olosuhteissa. Aktivoitaessa happokatalyytin vaikutuksesta tämä ryhmä korvataan kasvavan ketjun 5'-hydroksyyliryhmällä [22] .
Ei-nukleosidiset amidofosfiitit

Ei-nukleosidiamidofosfiitit ovat amidofosfiittireagensseja, jotka on suunniteltu lisäämään erilaisia ​​funktionaalisia ryhmiä ja leimoja oligonukleotidin pääteasemaan tai sekvenssin keskellä olevien nukleotiditähteiden väliin. Jotta amidofosfiitti soveltuu ketjun keskelle, sen tulee sisältää vähintään kaksi hydroksyyliryhmää, joista toinen on suojattu DMT-ryhmällä ja toisessa on reaktiivinen amidofosfiittiosa.

Ei-nukleosidiamidofosfiitteja käytetään tuomaan oligonukleotidiin erilaisia ​​ryhmiä, joita ei löydy luonnollisista nukleosideista. On syntetisoitu laaja valikoima samanlaisia ​​reagensseja, joita käytetään esimerkiksi 5'-fosfaatti [41] , aminoryhmä [42] , merkaptoryhmä [ 43] , aldehydi [44] ja karboksyyli [45] lisäämiseen, alkyynifragmentit [46] , fluoresoivat väriaineet [47] ja sammuttimet, hydrofiiliset [48] ja hydrofobiset [49] modifikaatiot, biotiini [50] jne.

Synteettinen sykli

Oligonukleotidien synteesi suoritetaan kondensoimalla rakennuspalikoita vaiheittain kasvavan ketjun 5'-päähän, kunnes kohdesekvenssi on koottu. Sivureaktioiden esiintyminen asettaa rajoituksen syntetisoidun oligonukleotidin pituudelle (jopa 200 nukleotiditähdettä ), koska virheiden määrä kasautuu kohdetuotteen pituuden kasvaessa [26] . Toimintajoukkoa, joka vaaditaan ketjun pidentämiseksi yhdellä nukleotiditähteellä, kutsutaan synteesisykliksi, ja se koostuu neljästä kemiallisesta reaktiosta.

Vaihe 1: Trityylisuojan poistaminen

DMT-suojaryhmä poistetaan happamalla liuoksella, kuten 2-prosenttisella trikloorietikkahapolla tai 3-prosenttisella dikloorietikkahapolla inertissä liuottimessa ( metyleenikloridi tai tolueeni ). Saatu oranssi dimetoksitrityylikationi pestään pois järjestelmästä. Tuloksena muodostuu oligonukleotidiprekursori, jossa on vapaa 5'-hydroksyyliryhmä, joka on kiinnittynyt kiinteän faasin kantajaan. Prosessin suorittaminen pidempään tai väkevämpien happoliuosten käyttö johtaa depurinaation sivureaktioon - puriiniemästen  eliminoitumiseen riboosijäännöksestä .

Vaihe 2: Kondensaatio

Nukleosidiamidofosfiittiliuos (0,02–0,2 M) tai useiden amidofosfiittien seos asetonitriilissä aktivoidaan 0,2–0,7 M happokatalyyttiliuoksella, joka perustuu atsoliin : 1 H - tetratsoli , 2 - etyylitiotetratsoli [21] , , . -bentsyylitiotetratsoli [52] , 4,5-disyaani-imidatsoli [53] jne. Komponenttien sekoittuminen tapahtuu syntetisaattorin tietoliikennelinjoissa reagenssien toimituksen aikana kiinteäfaasista kantajaa sisältävään reaktoriin. Aktivoitua amidofosfiittia 1,5-20-kertainen ylimäärä saatetaan vuorovaikutukseen 5'-hydroksyyliryhmän kanssa, jolloin muodostuu fosfiittitriesterisidos. 2'-deoksinukleosidien amidofosfiittien kondensaatio etenee hyvin nopeasti ja kestää yleensä noin 20 sekuntia pienessä mittakaavassa. Ribonukleosidien steerisesti estyneet amidofosfiitit reagoivat paljon hitaammin (5-15 min) [54] [55] [56] [57] . Reaktio on melko herkkä veden läsnäololle, varsinkin kun käytetään laimeita amidofosfiittiliuoksia, joten se suoritetaan vedettömässä liuottimessa, yleensä asetonitriilissä . Synteesin laajuuden kasvaessa käytetään pienempiä ylimääriä ja väkevämpiä amidofosfiittiliuoksia. Reaktion päätyttyä ylimääräiset lähtöaineet ja sivutuotteet poistetaan reaktorista pesemällä.

Vaihe 3: Rajaus

Päällystys suoritetaan käsittelemällä kiinteäfaasista kantajaa etikkahappoanhydridin ja 1-metyyli-imidatsolin (harvemmin DMAP ) seoksella katalyyttinä . Amidofosfiittisynteesissä tällä vaiheella on kaksi tarkoitusta:

  • Kondensaatiovaiheen päätyttyä pieni osa 5'-hydroksyyliryhmistä (0,1-1 %) jää reagoimatta ja se on poistettava ketjun lisäpidennysprosessista, jotta estetään oligonukleotidien muodostuminen, joista puuttuu nukleotiditähteitä. ketju. Tätä tarkoitusta varten jäljellä olevat hydroksyyliryhmät suojataan asetyyliryhmillä, jotka kestävät DMT-suojauksen poistamiseen käytettäviä happoliuoksia.
  • On myös raportoitu, että 1 H -tetratsolilla aktivoidut amidofosfiitit reagoivat alhaisella saannolla karbonyylihapen kanssa guanosiinin 06 - asemassa [58] . Kun tämä sivutuote hapetetaan jodin ja veden seoksella, puriiniemäs pilkkoutuu . Tuloksena olevat apuriinikohdat hydrolysoituvat helposti oligonukleotidin lopullisen suojauksen poiston aikana, mikä johtaa kahden lyhyemmän oligonukleotidin muodostumiseen ja kohdetuotteen saannon vähenemiseen. 06 - muunnokset poistetaan nopeasti päällystysaineen vaikutuksesta, jos päällystys suoritetaan ennen hapetusvaihetta.
Vaihe 4: Hapetus

Kondensoinnin tuloksena saatu nukleosidien välinen kolmikoordinoitu fosfiittiryhmä ei ole luonnollinen ja sillä on rajoitettu stabiilisuus synteesiolosuhteissa. Kantajan käsittely jodilla ja vedellä heikon emäksen ( pyridiini , 2,6-lutidiini tai kollidiini ) läsnä ollessa hapettaa fosfiitin fosfotriesteriksi, luonnollisen fosfodiesterien välisen nukleosidisidoksen esiasteena. Hapetus voidaan suorittaa myös vedettömissä olosuhteissa käyttäen tert-butyylihydroperoksidia [59] tai sopivampaa reagenssia, ( 1S )-(+)-(10-kamferisulfonyyli)oksatsiridiiniä [60] .

Solid state -kantolaitteet

Koko kiinteän faasin synteesin ajan oligonukleotidi sitoutuu kovalenttisesti kiinteän faasin kantajaan 3'-hydroksyyliryhmän kautta. Tuki sijoitetaan yleensä sarakkeisiin, joiden koko riippuu synteesin mittakaavasta. Viimeisen 10 vuoden aikana suuren suorituskyvyn oligonukleotidisyntetisaattorit ovat yleistyneet, joissa kantaja sijoitetaan levyn kuoppiin (96 tai 384 kuoppaa levyä kohden) [61] . Synteesin päätyttyä oligonukleotidi lohkaistaan ​​kantajasta ja menee liuokseen.

Mediamateriaali
CPG-huokoskoko, Å [62] Lataus,
µmol/g		 Tuotteen pituus,
pohjat
500 80-90 <50
1000 50-60 80
1500 35-45 100
2000 20-30 150
3000 200

Toisin kuin orgaaninen kiinteäfaasinen synteesi ja peptidisynteesi, oligonukleotidisynteesi etenee paremmin turpoamattomilla tai heikosti turpoavilla kiinteän faasin kantajilla. Yleisimmin käytetyt kantoaineet ovat kontrolloitu huokoslasi (CPG) ja makrohuokoinen polystyreeni (MPPS) [ 63] . 

  • CPG:n pääominaisuus on huokosten halkaisija , joka voi olla 70 - 4000 Å , kun taas huokoset ovat kooltaan hyvin tasalaatuisia (poikkeama on ±10 % 80 %:lla huokosista). Jotta tällainen kantaja olisi sopiva synteesiin, sitä käsitellään (3-aminopropyyli)trietoksisilaanilla (APTES), jolloin saadaan aminopropyyli-CPG. Usein käytetään myös pitkäketjuista  aminoalkyyli-CPG :tä , LCAA CPG: tä [63] . Kaksi synteesin keskeistä ominaisuutta riippuvat huokoskoosta: mittakaava, jonka määrittää aktiivisten funktionaalisten ryhmien lukumäärä kantajan massayksikköä kohti, ja syntetisoidun oligonukleotidin maksimipituus. Taulukossa [62] on tiedot yleisimmistä CPG-kantoaaloista .
  • Myös oligonukleotidien synteesissä käytetään makrohuokoista polystyreeniä, joka on saatu styreenin ja divinyylibentseenin kopolymeroinnilla , johon on lisätty aminometyylimuunnos. Tämä polystyreeni mahdollistaa alle 40–50 emäksen pituisten oligonukleotidien syntetisoinnin. Pienissä synteeseissä voidaan käyttää polystyreenikantajaa, jonka kuormitus on 10-45 µmol/g. 25–100 µmol:n synteeseihin käytetään polystyreeniä, jonka kuormitus on 200–400 µmol/g. Lopuksi, polystyreeni on sopivampi kuin CPG suuren mittakaavan synteeseihin (yli 100 µmol) [62] .
Linkkerikemia

Oligonukleotidisynteesiä varten nukleosidisukkinaatit tai ei-nukleosidilinkkerit kiinnitetään kovalenttisesti aminopropyyli-CPG:n, LCAA CPG:n tai aminometyyli-MPPS:n aminoryhmiin. Tyypillisesti käytetään kolmea erityyppistä mediaa.

  • Nukleosidin kantajat . Historiallisesti ensimmäisessä lähestymistavassa oligonukleotidin synteesi suoritetaan kantajalla, johon 3'-terminaalinen aloitusnukleosidi on kiinnitetty kovalenttisesti etukäteen meripihkahappofragmentin kautta. Vastaavasti synteesi alkaa amidofosfiitin lisäämisellä, joka ei vastaa ensimmäistä, vaan toista nukleotidia 3'-päästä laskettuna. Tällaisen kantajan haittana on, että ennen synteesin aloittamista on tarpeen valita nukleosidikantajavariantti, joka vastaa syntetisoidun oligonukleotidin 3'-terminaalista nukleosidia, mikä vähentää synteesiprosessin tuottavuutta ja lisää inhimillisen virheen todennäköisyyttä. [64] . Vaihtoehtoisia kiinteän faasin kantajia, joissa on diglykoli- ja oksaalihappoihin perustuva välike , on myös ehdotettu tuotteen nopeampaan erottamiseen kantajasta [63] .
  • Universaali media . Tässä menetelmässä synteesi alkaa yleiskantajalla, johon on kiinnitetty ei-nukleosidilinkkeri [65] . Amidofosfiitti, joka vastaa 3'-terminaalista nukleosidia, kiinnitetään yleiskantajaan standardimenetelmien mukaisesti ensimmäisen synteesisyklin aikana. Tämän jälkeen jatketaan halutun sekvenssin kokoamista ja sitten oligonukleotidi lohkaistaan ​​kantajan pinnalta. Tämän lähestymistavan etuna on, että kaikissa synteeseissä, riippumatta siitä, mikä sekvenssi on syntetisoitava, voidaan käyttää yhtä universaalia kantoaaltoa [64] .
  • Erityisiä tukia käytetään liittämään jokin toiminnallinen tai reportteriryhmä synteettisten oligonukleotidien 3'-asemaan. Kantaja-aineita on kaupallisesti saatavilla aminoryhmien [66] , merkaptoryhmien [ 67] , fluoresenssisammuttimien [68] jne.

Tiofosfaattioligonukleotidit ja niiden synteesi

Tiofosfaattioligonukleotidit ovat modifioituja oligonukleotideja, joissa yksi fosfaattitähteen happiatomeista on korvattu rikkiatomilla . Vain niitä tiofosfaatteja käytetään laajalti, joissa rikki ei ole linkki nukleosiditähteen ja fosforiatomin välillä. Tässä tapauksessa hapen korvaaminen rikillä johtaa uuden kiraalisuuden keskuksen muodostumiseen P (V)-atomiin, joten dinukleotidin yksinkertaisimmassa tapauksessa muodostuu S P - ja RP - diastereomeerejä . N - meerisessä oligonukleotidissa, jossa kaikki ( n -1) nukleotidien väliset sidokset ovat tiofosfaattia, diastereomeerien lukumäärä on 2 ( n - 1) . Nukleiinihappojen ei-luonnollisina analogeina oligonukleotiditiofosfaatit vastustavat huomattavasti paremmin nukleaasien hydrolyysiä , jotka ovat entsyymiluokka , joka pilkkoo nukleiinihappoja fosfodiesterisillan PO-sidoksen hydrolyysillä. Tämä ominaisuus määrää tiofosfaattien käytön antisense -oligonukleotideina in vivo- ja in vitro -sovelluksissa , joissa nukleaaseille altistumista ei voida välttää. Samalla tavalla pienten häiritsevien RNA:iden stabiiliuden lisäämiseksi vähintään yksi tiofosfaattisidos liitetään usein sense- ja antisense-juosteiden 3'-asentoon. Optisesti puhtaissa oligonukleotiditiofosfaateissa diastereomeerit, joissa kaikilla fosforikeskuksilla on SP- konfiguraatio , vastustavat entsymaattista hydrolyysiä paremmin kuin niiden RP - vastineet . Optisesti puhtaiden tiofosfaattien synteesi on kuitenkin vaikeaa [69] [70] .

Oligonukleotiditiofosfaattien synteesi on samanlainen kuin luonnollisten oligonukleotidien synteesi. Erona on, että hapetusvaihe korvataan rikitysreaktiolla. Seuraavia kaupallisesti saatavia reagensseja käytetään rikin lisäämiseen:

  • 3-(dimetyyliaminometylideeniamino)-3H-1,2,4-ditiatsoli-3-tioni ( DDTT ) tarjoaa korkean rikkimuodostuksen ja on stabiili liuoksessa [71] .
  • Beaucage -  reagenssilla on korkeampi liukoisuus asetonitriiliin ja se mahdollistaa reaktion edetä lyhyemmässä ajassa . Sillä on kuitenkin rajallinen stabiilisuus liuoksessa ja se on vähemmän tehokas RNA-sidosten rikittämisessä [72] .
  • N,N,N',N'-tetraetyylitiuraamidisulfidi ( TETD ) liukenee asetonitriiliin, mutta DNA:n nukleosidisidoksen rikiytymisreaktio kestää 15 minuuttia, mikä on 10 kertaa hitaampaa kuin kahdella aikaisemmalla yhdisteellä [ 73] .

Myös muita rikkipitoisia reagensseja on kehitetty [74] .

Tiofosfaattioligonukleotidien synteesissä katkaisuvaihe suoritetaan sulfuroinnin jälkeen. Jos päällykset suoritetaan ennen rikitystä, kiinteäfaasikantaja voi peittämisen jälkeen sisältää jäännösmääriä etikkahappoanhydridiä ja 1-metyyli-imidatsolia. Päällystysseos estää rikin siirtoreaktion, mikä johtaa tiofosfaattioligonukleotidien muodostumiseen, joissa on lisääntynyt fosfaattiyksiköiden pitoisuus. Tässä tapauksessa on suositeltavaa suorittaa korkki sulfurointireaktion jälkeen [71] .

Automaatio

Aikaisemmin oligonukleotidisynteesi suoritettiin manuaalisesti liuoksessa tai kiinteässä faasissa. Kiinteäfaasisynteesiä varten on sovitettu erilaisia ​​laitteita, jotka perustuvat huokoisilla kalvoilla varustettuihin ruiskuihin tai pienoislasisuodattimiin, jotka mahdollistavat kiinteän faasin kantajan pesun reagenssiliuoksilla ja poistamisen tyhjiöllä [76] .

Tällä hetkellä kiinteän faasin synteesi suoritetaan automaattisesti tietokoneohjatuissa oligonukleotidisyntetisaattoreissa. Nämä laitteet koostuvat sarjasta reagenssisäiliöihin kytkettyjä venttiileitä sekä solenoideja , jotka avaavat tai sulkevat yhden tai toisen venttiilin. Solenoideja puolestaan ​​ohjaa synteesiohjelmaa suorittava tietokone. Kun venttiili on auki, tietty reagenssi pumpataan kiinteän faasin kantajaa sisältävän kolonnin läpi ohjelman määrittämän ajan. Reagenssin syöttöaika ja järjestys ovat vakioita jokaiselle synteesijaksolle; ainoa muuttuja on monomeerinen lähtöaine, joka on kondensoitava tietyssä syklissä. Sen valinnan tekee myös ohjelma määritellyn oligonukleotidisekvenssin mukaisesti [77] .

Synteesi voidaan toteuttaa kolonni-, levy- tai sirumuodossa. Pylvässynteesimenetelmä soveltuu näiden polymeerien tutkimukseen tai laajamittaiseen synteesiin, jossa niiden synteesin suurta suorituskykyä ei vaadita. Levymuoto on suunniteltu erityisesti korkean suorituskyvyn pienimuotoiseen synteesiin vastaamaan synteettisten oligonukleotidien kasvavaan kysyntään teollisuudessa ja tieteessä. Erilaisia ​​syntetisaattoreita on kaupallisesti saatavilla [78] [79] [80] .

Synteettinen käsittely

Kohdeoligonukleotidin saamiseksi on tarpeen poistaa kaikki oligonukleotidin suojaryhmät :

  • 5' DMT-ryhmä;
  • asyylisuojaryhmät typpipitoisilla emäksillä;
  • 2-syaanietyyliryhmät, jotka suojaavat nukleosidien välisiä fosfaattiryhmiä.

5'-DMT-ryhmä poistetaan yleensä happoliuoksella automaattisen synteesin aikana. Oligonukleotidin katkaisu alustasta, suojauksen poisto emäksistä ja syanoetyylisuojaryhmistä tapahtuu tavallisesti samanaikaisesti epäorgaanisten emästen tai amiinien vaikutuksesta . Yleensä näihin tarkoituksiin käytetään vesipitoista ammoniakkia , metyyliamiinin liuosta , niiden seoksia [30] , kaasumaista ammoniakkia tai metyyliamiinia [81] , harvemmin muiden primääristen amiinien ja alkalien liuoksia huoneen- tai korotetussa lämpötilassa. Tämä käsittely poistaa kaikki suojaryhmät 2'-deoksioligonukleotideista, jolloin lopputuotteesta jää liuos. 2'- O -silyylisuojattujen oligoribonukleotidien tapauksessa lisätään vaihe silyylisuojaryhmien poistamiseksi fluoridi-ionin vaikutuksesta [82] .

Tämän menetelmän soveltamista rajoittaa se tosiasia, että tämä käsittely tuottaa akryylinitriiliä sivutuotteena . Suojauksenpoisto-olosuhteissa akryylinitriili voi alkyloida typpipitoisia emäksiä, pääasiassa tymiinin ja urasiilin N3-asemaa , muodostaen 2-syaanietyylijohdannaisia ​​Michael-reaktiolla . Näiden sivutuotteiden muodostuminen voidaan välttää käsittelemällä kiinteän faasin kantajaan sitoutuneita oligonukleotideja emäsliuoksilla orgaanisessa liuottimessa, kuten 50 % trietyyliamiini asetonitriilissä [ 83] tai 10 % dietyyliamiini asetonitriilissä [84] .

Suojaamatonta oligonukleotidia voidaan käyttää ilman lisäpuhdistusta tai sitä voidaan puhdistaa edelleen jollakin seuraavista menetelmistä [85] .

  • Karkein menetelmä oligonukleotidin puhdistamiseksi on suolanpoisto, eli suojaryhmien ( bentsamidi , isobutyramidi , ammoniumasetaatti jne.) poiston aikana muodostuneiden pienimolekyylisten epäpuhtauksien erottaminen . Suurille oligonukleotidimäärille suolanpoisto suoritetaan kätevästi saostamalla etanolissa : tässä tapauksessa tuote saostuu, kun taas epäpuhtaudet ja joissakin tapauksissa lyhyemmät oligonukleotidit jäävät liuokseen. Pienille määrille käytetään geelisuodatusta [86] .
  • Typistettyjen oligonukleotidien puhdistus voidaan suorittaa tehokkaasti käyttämällä polyakryyliamidigeelielektroforeesia , joka perustuu oligonukleotidien erottamiseen koon mukaan niiden erilaisesta liikkuvuudesta geelissä sähkökentän vaikutuksesta. Ultraviolettiabsorptioelektroforeesin jälkeen kohdeoligonukleotidin sisältävä geelifragmentti määritetään, tämä osa leikataan pois ja puhdistettu oligonukleotidi eristetään liottamalla tai elektroeluutiolla [87] .
  • Täydellisin puhdistus saavutetaan käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC). Tässä menetelmässä erotus perustuu oligonukleotidien hydrofobiseen (käänteisfaasi-HPLC) tai varauksen (ioninvaihto-HPLC) vuorovaikutukseen sorbentin kanssa. Tämän vuorovaikutuksen voimakkuus vaikuttaa tuotteen kromatografiapylväästä eluoitumisen järjestykseen ja aikaan, mikä mahdollistaa eripituisten tuotteiden tehokkaan erottamisen. Usein käytetään vaihtoehtoista lähestymistapaa, jossa oligonukleotidin 5'-DMT-ryhmää ei poisteta ennen puhdistusta. Tässä tapauksessa hydrofobisen suojaryhmän läsnäolon vuoksi sen hydrofobisuus ja vuorovaikutuksen voimakkuus hydrofobisen sorbentin kanssa kasvavat merkittävästi, ja kromatografinen liikkuvuus vähenee, mikä tekee tuotteen eristämisestä tehokkaampaa. DMT-ryhmä poistetaan sitten happamassa väliaineessa, ja liuoksesta haihdutetaan ja siitä poistetaan suola [88] .

Karakterisointi

Kuten muidenkin orgaanisten aineiden kohdalla, on hyödyllistä karakterisoida oligonukleotidi sen valmistuksen jälkeen. Monimutkaisemmissa tapauksissa (tutkimus tai laajamittainen synteesi) tämä tehdään kahdesti: suojauksen poistamisen ja puhdistuksen jälkeen. Vaikka oikein lähestymistapa oligonukleotidin karakterisoimiseksi on sekvensointi , suhteellisen halpa ja rutiinimenettely, taloudelliset näkökohdat estävät sen sisällyttämisen oligonukleotidien tuotantoon. Päivittäisessä käytännössä riittää , että oligonukleotidin molekyylipaino saadaan kirjaamalla sen massaspektri . Massaspektrometriassa käytetään kahta menetelmää: sähkösumutusta ja MALDI - massaspektrometriaa. Informatiivisen spektrin saamiseksi on tärkeää korvata kaikki näytteessä mahdollisesti olevat metalli-ionit ammonium- tai trialkyyliammoniumioneilla.

  • Kun oligonukleotidi ionisoidaan sähkösuihkulla, se tuottaa joukon ioneja, jotka vastaavat yhdisteen eri ionisaatioasteita. Oligonukleotidi, jonka molekyylipaino on M , antaa ioneja, joiden massa on ( M  - n H) / n , missä M  on oligonukleotidin molekyylipaino happomuodossa (kaikki fosfodiesterisidosten negatiiviset varaukset kompensoidaan protonien läsnäololla), n  on ionisaatioaste, H on vetyatomin atomimassa (1 Kyllä). Ionit, joiden n on 2 - 5, ovat hyödyllisimpiä karakterisointiin . Nykyaikaisten instrumenttien mukana toimitettu ohjelmisto pystyy automaattisesti etsimään tiettyyn oligonukleotidiin kuuluvia ionipiikkejä ja laskemaan jälkimmäisen molekyylipainon.
  • Yksityiskohtaisemman tiedon saamiseksi oligonukleotidin epäpuhtauksista käytetään analyyttisiä menetelmiä, joissa yhdistyvät HPLC ja massaspektrometria [89] tai kapillaarielektroforeesi ja massaspektrometria [90] .

Katso myös

Muistiinpanot

  1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Reese CB Oligo- ja polynukleotidit: 50 vuotta kemiallista synteesiä   // Org . Biomol. Chem. - 2005. - Voi. 3 , ei. 21 . - P. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .
  2. ↑ Brown DM Lyhyt oligonukleotidisynteesin historia // Oligonukleotidien ja analogien protokollat: synteesi ja ominaisuudet. - Springer, 1993. - s. 1-17. — (Methods in Molecular Biology). - doi : 10.1385/0-89603-281-7:1 .
  3. ↑ Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Oligonukleotidisynteesi // Comprehensive Natural Products Chemistry. - Elsevier, 1999. - P. 105-152.
  4. ↑ Michelson AM, Todd AR Nucleotides osa XXXII. Ditymidiinidinukleotidin synteesi, joka sisältää 3':5'-nukleotidien välisen sidoksen  (englanniksi)  // J. Chem. soc. - 1955. - P. 2632-2638 . - doi : 10.1039/JR9550002632 .
  5. ↑ Hall RH, Todd A., Webb RF 644. Nukleotidit. Osa XLI. Sekaanhydridit välituotteina dinukleosidifosfaattien synteesissä  //  J. Chem. soc. - 1957. - S. 3291-3296 . - doi : 10.1039/JR9570003291 .
  6. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD DNA:n synteesi deoksinukleosidi-H-fosfonaattivälituotteiden kautta   // Nucl . Acids Res. - 1986. - Voi. 14 , ei. 13 . - P. 5399-5407 . doi : 10.1093 / nar/14.13.5399 . Arkistoitu alkuperäisestä 6. toukokuuta 2022.
  7. ↑ Garegg PJ, Lindh I., Regberg T., Stawinski J., Strömberg R. Nucleoside H-phosphonates. III. Oligodeoksiribonukleotidien kemiallinen synteesi vetyfosfonaattimenetelmällä  (englanniksi)  // Tetrahedron Lett. - 1986. - Voi. 27 , ei. 34 . - P. 4051-4054 ​​. - doi : 10.1016/S0040-4039(00)84908-4 .
  8. ↑ 1 2 Wada T., Sato Y., Honda F., Kawahara S., Sekine M. Oligodeoksiribonukleotidien kemiallinen synteesi käyttämällä N-suojaamattomia H-fosfonaattimonomeereja ja karboniumin ja fosfoniumin kondensaatioreagensseja: O-selektiivinen fosfonointi //kondensointi .Amer. Chem. soc. - 1997. - T. 119 , nro 52 . - S. 12710-12721 . - doi : 10.1021/JA9726015 .
  9. ↑ Agrawal S., Tang JY Oligoribonukleotidin ja sen fosforotioaattianalogin tehokas synteesi käyttämällä H-fosfonaattilähestymistapaa // Tetrahedron Lett. - 1990. - T. 31 , nro 52 . - S. 7541-7544 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)97293-9 .
  10. ↑ Tram K., Wang X., Yan H. Oligonucleotide Phosphoroselenoates helppo synteesi // Org. Lett. - 2007. - T. 9 , nro 24 . - S. 5103-5106 . - doi : 10.1021/ol702305v .
  11. ↑ Froehler BC Deoksinukleosidi-H-fosfonaattidiesterivälituotteet nukleotidien välisten fosfaattianalogien synteesissä // Tetrahedron Lett. - 1986. - T. 27 , nro 46 . - S. 5575-5578 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)85269-7 .
  12. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD DNA:n fosforamidaattianalogit: heterodupleksien synteesi ja lämpöstabiilisuus // Nucl. Acids Res. - 1988. - T. 16 , nro 11 . - S. 4831-4839 . doi : 10.1093 / nar/16.11.4831 .
  13. ↑ Kung PP, Jones RA H-fosfonaatti-DNA-synteesi ilman aminosuojausta // Tetrahedron Lett. - 1992. - T. 33 , nro 40 . - S. 5869-5872 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)61075-4 .
  14. ↑ Gilham PT, Khorana HG Polynukleotidien tutkimukset. I. Uusi ja yleinen menetelmä C5″-C3″ internukleotidisen sidoksen kemialliseen synteesiin. Deoksiribo-dinukleotidien synteesit  (englanniksi)  // J. Am. Chem. soc. - 1958. - Voi. 80 , ei. 23 . - P. 6212-6222 . - doi : 10.1021/ja01556a016 .
  15. ↑ Letsinger RL, Mahadevan V. Oligodeoksiribonukleotidien vaiheittainen synteesi liukenemattomalla polymeerikantajalla  //  J. Am. Chem. soc. - 1966. - Voi. 88 , no. 22 . - P. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.
  16. ↑ Letsinger RL, Ogilvie KK Nukleotidikemia. XIII. Oligotymidylaattien synteesi fosfotriesterivälituotteiden kautta  (englanniksi)  // J. Am. Chem. soc. - 1969. - Voi. 91 , ei. 12 . - P. 3350-3355 . - doi : 10.1021/ja01040a042 .
  17. ↑ Reese CB Oligo- ja polynukleotidien kemiallinen synteesi fosfotriesterimenetelmällä   // Tetrahedron . - 1978. - Voi. 34 , no. 21 . - s. 3143-3179 . - doi : 10.1016/0040-4020(78)87013-6 .
  18. ↑ Efimov VA, Buryakova AA, Reverdatto SV, Chakhmakhcheva OG, Ovchinnikov Yu. A. Pitkäketjuisten deoksiribooligonukleotidien nopea synteesi N-metyyli-imidatsolidifosfotriesterimenetelmällä   // Nucl . Acids Res. - 1983. - Voi. 11 , ei. 23 . - P. 8369-8387 . doi : 10.1093 / nar/11.23.8369 . Arkistoitu alkuperäisestä 6. toukokuuta 2022.
  19. ↑ Efimov VA, Molchanova NS, Chakhmakhcheva OG Lähestymistapa luonnollisten ja modifioitujen oligonukleotidien synteesiin fosfotriesterimenetelmällä käyttäen O-nukleofiilistä intramolekulaarista katalyysiä  //  Nukleosidit, nukleotidit ja nukleiinihapot. - 2007. - Voi. 26 , nro. 8-9 . - s. 1087-1093 . - doi : 10.1080/15257770701516268 . — PMID 18058542 .
  20. ↑ Letsinger RL, Finnan JL, Heavner GA, Lunsford WB Nukleotidikemia. XX. Fosfiittikytkentämenettely nukleotidien välisten linkkien muodostamiseksi  //  J. Am. Chem. soc. - 1975. - Voi. 97 , no. 11 . - P. 3278-3279 . - doi : 10.1021/ja00844a090 . — PMID 1133350 .
  21. ↑ Matteucci MD, Caruthers MH Deoksioligonukleotidien synteesi polymeerikantajalla  //  J. Am. Chem. soc. - 1981. - Voi. 103 , no. 11 . - s. 3185-3191 . - doi : 10.1021/ja00401a041 .
  22. ↑ 1 2 3 Beaucage SL, Caruthers MH Deoksinukleosidifosforamidiitit – uusi luokka keskeisiä välituotteita deoksipolynukleotidisynteesiin  //  Tetrahedron Lett. - 1981. - Voi. 22 , ei. 20 . - P. 1859-1862 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)90461-7 .
  23. ↑ McBride LJ, Caruthers MH Nukleotidikemia. X. Tutkimus useista deoksinukleosidifosforamidiiteista, jotka ovat käyttökelpoisia deoksioligonukleotidien syntetisoinnissa // Tetrahedron Lett. - 1983. - T. 24 , nro 3 . - S. 245-248 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)81376-3 .
  24. ↑ Adams SP, Kavka KS, Wykes EJ, Holder SB, Galluppi GR Estetyt dialkyyliaminonukleosidifosfiittireagenssit kahden DNA:n 51-meerin synteesissä // J. Amer. Chem. soc. - 1983. - T. 105 , nro 3 . - S. 661-663 . - doi : 10.1021/ja00341a078 .
  25. ↑ 1 2 Sinha ND, Biernat J., McManus J., Köster H. Polymeerin tukioligonukleotidisynteesi XVIII1.2): deoksinukleosidien β-syaanietyyli-N,N-dialkyyliamino-/N-morfolinofosforamidiitin käyttö DNA:n deoksinukleosidien synteesiin fragmentit, jotka yksinkertaistavat suojauksen poistamista ja lopputuotteen eristämistä   // Nucl . Acids Res. - 1984. - Voi. 12 , ei. 11 . - P. 4539-4557 . doi : 10.1093 / nar/12.11.4539 .
  26. ↑ 1 2 Beaucage SL, Iyer RP Advances in the Synthesis of oligonukleotides by the Phosphoramidite Approach   // Tetrahedron . - 1992. - Voi. 48 , no. 12 . - P. 2223-2311 . - doi : 10.1016/S0040-4020(01)88752-4 .
  27. ↑ Glen Research. Applied Biosystemsin DNA- ja RNA-  syntetisaattorireagenssit . Haettu 2. joulukuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 16. tammikuuta 2013.
  28. ↑ Gryaznov SM, Letsinger RL Oligonukleotidien synteesi monomeerien kautta suojaamattomilla emäksillä  //  J. Am. Chem. soc. - 1991. - Voi. 113 , nro. 15 . - P. 5876-5877 . doi : 10.1021 / ja00015a059 .
  29. ↑ Virta P. Emäsherkkien oligonukleotidien kiinteäfaasinen synteesi   // ARKIVOC . - 2009. - s. 54-83 . - ISSN 1551-7012 . Arkistoitu alkuperäisestä 11. lokakuuta 2015.
  30. ↑ 1 2 3 Reddy MP, Hanna NB, Farooqui F. Ultranopea  oligonukleotidien pilkkominen ja suojauksen poistaminen C Ac -johdannaisten synteesi ja käyttö //  Nukleosidit ja nukleotidit. - 1997. - Voi. 16 , ei. 7-9 . - s. 1589-1598 . - doi : 10.1080/07328319708006236 .
  31. ↑ McMinn DL, Greenberg MM 3'-alkyyliamiineja sisältävien oligonukleotidien synteesi käyttämällä N-isobutyryylisuojattua deoksiadenosiinifosforamidiittia  //  Tetrahedron Lett. - 1997. - Voi. 38 , ei. 18 . - s. 3123-3126 . - doi : 10.1016/S0040-4039(97)00568-6 .
  32. ↑ Schulhof JC, Molko D., Teoule R. Oligonukleotidisynteesin viimeinen suojauksen poistovaihe pelkistetään miedoksi ja nopeaksi ammoniakkikäsittelyksi käyttämällä labiileja  emässuojaryhmiä  // Nucl . Acids Res. - 1987. - Voi. 15 , ei. 2 . - s. 397-416 . doi : 10.1093 / nar/15.2.397 . — PMID 3822812 . Arkistoitu alkuperäisestä 14. maaliskuuta 2022.
  33. ↑ Zhu Q., Delaney MO, Greenberg MM . Nopeasti poistavia fosforamidiitteja ja erittäin lievää suojauksenpoistoa käyttäen valmistettujen oligonukleotidien N-asetylaation havainnointi ja eliminointi   // Bioorg . Med. Chem. Lett. - 2001. - Voi. 11 , ei. 9 . - s. 1105-1107 . - doi : 10.1016/S0960-894X(01)00161-5 . — PMID 11354354 .
  34. ↑ McBride LJ, Kierzek R., Beaucage SL, Caruthers MH Nucleotide chemistry. 16. Amidiinia suojaavat ryhmät oligonukleotidisynteesiä varten  (englanniksi)  // J. Am. Chem. soc. - 1986. - Voi. 108 , no. 8 . - s. 2040-2048 . doi : 10.1021 / ja00268a052 .
  35. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. Fosforamidiittikytkentä oligonukleotideihin, joissa on suojaamattomia nukleosidisten fosfaattiosien osia  //  J. Org. Chem. - 2001. - Voi. 66 , nro. 5 . - P. 1798-1804 . - doi : 10.1021/jo001591e . — PMID 11262130 .
  36. ↑ Ogilvie KK, Theriault N., Sadana KL Synthesis of  Oligoribonucleotides //  J. Am. Chem. soc. - 1977. - Voi. 99 , ei. 23 . - P. 7741-7743 . - doi : 10.1021/ja00465a073 .
  37. ↑ Usman N., Pon RT, Ogilvie KK Ribonukleosidi-3'-O-fosforamidiittien valmistaminen ja niiden soveltaminen oligonukleotidien automatisoituun kiinteäfaasisynteesiin  //  Tetrahedron Lett. - 1985. - Voi. 26 , nro. 38 . - P. 4567-4570 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)98753-7 .
  38. ↑ Scaringe SA, Francklyn C., Usman N. Biologisesti aktiivisten oligoribonukleotidien kemiallinen synteesi käyttämällä β-syanoetyylisuojattuja ribonukleosidifosforamidiitteja   // Nucl . Acids Res. - 1990. - Voi. 18 , ei. 18 . - P. 5433-5441 . doi : 10.1093 / nar/18.18.5433 .
  39. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Wu X., Ackermann D., Honegger T. RNA:n ja osittain 2′-O-suojattujen esiasteiden ("Caged RNA") nopea ja luotettava automatisoitu synteesi, joka perustuu kahteen uuteen, ortogonaaliseen 2'- O-suojaryhmät, alustava viestintä   // Helv . Chem. acta. - 1999. - Voi. 82 , no. 10 . - P. 1753-1761 . - doi : 10.1002/(SICI)1522-2675(19991006)82:10<1753::AID-HLCA1753>3.0.CO;2-Y .
  40. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Jenny L., Stutz A., Wu X. Oligoribonukleotidien (RNA) luotettava kemiallinen synteesi 2'-O-[(tri-isopropyylisilyyli)oksi]metyyli(2'-O-tom)-suojatulla Fosforamidiitit  (englanniksi)  // Helv. Chem. acta. - 2001. - Voi. 84 , nro. 12 . - P. 3773-3795 . - doi : 10.1002/1522-2675(20011219)84:12<3773::AID-HLCA3773>3.0.CO;2-E .
  41. ↑ Guzaev A., Salo H., Azhayev A., Lönnberg H. Uusi lähestymistapa oligonukleotidien kemialliseen fosforylaatioon 5'-päässä   // Tetrahedron . - 1995. - Voi. 51 , no. 34 . - P. 9375-9384 . - doi : 10.1016/0040-4020(95)00544-I .
  42. ↑ Sinha ND, Cook RM Funktionalisoitujen synteettisten oligonukleotidien valmistus ja käyttö: III. Suojatun aminoheksanolin ja merkaptopropanolin tai -heksanolin H-fosfonaattijohdannaisten käyttö  //  Nucl. Acids Res. - 1988. - Voi. 16 , ei. 6 . - P. 2659-2670 . doi : 10.1093 / nar/16.6.2659 . Arkistoitu alkuperäisestä 6. toukokuuta 2022.
  43. ↑ Ede NJ, Tregear GW, Haralambidis J. Rutine Preparation of Tiol Oligonukleotids: Application to the Synthesis of Oligonukleotid-Peptide Hybrids  //  Bioconjugate Chem. - 1994. - Voi. 5 , ei. 4 . - s. 373-378 . doi : 10.1021 / bc00028a016 . — PMID 7948105 .
  44. ↑ Podyminogin MA, Lukhtanov EA, Reed MW Bentsaldehydimodifioitujen oligodeoksinukleotidikoettimien kiinnittäminen semikarbatsidilla päällystettyyn lasiin   // Nucl . Acids Res. - 2001. - Voi. 29 , ei. 24 . - P. 5090-5098 . doi : 10.1093 / nar/29.24.5090 .
  45. ↑ Lebedev AV, Combs D., Hogrefe RI esiaktivoitu karboksyylilinkkeri alkyyliamiinien nopeaan konjugoimiseen oligonukleotideihin kiinteällä alustalla  //  Bioconjugate Chem. - 2007. - Voi. 18 , ei. 5 . - s. 1530-1536 . doi : 10.1021 / bc0603891 . — PMID 17877414 .
  46. ↑ Alvira M., Eritja R. 5'-5'-sidoksia sisältävien oligonukleotidien synteesi käyttämällä kuparikatalysoituja sykloaditioreaktioita   // Chem . biologista monimuotoisuutta. - 2007. - Voi. 4 , ei. 12 . - P. 2798-2809 . - doi : 10.1002/cbdv.200790229 . — PMID 18081090 .
  47. ↑ Kvach MV, Tsybulsky DA, Ustinov AV, Stepanova IA, Bondarev SL, Gontarev SV, Korshun VA, Shmanai VV 5(6 ) -Carboxyfluorescein Revisited: New Protecting Group, Separation of Isomers, and their Spektral Properties on  Chemical/Oligonm/  Checktral Properties . - 2007. - Voi. 18 , ei. 5 . - P. 1691-1696 . - doi : 10.1021/bc7001874 . — PMID 17696491 .
  48. ↑ Jäschke A., Fürste JP, Nordhoff E., Hillenkamp F., Cech D., Erdmann VA Oligodeoksiribonukleotidi-polyetyleeniglykolikonjugaattien synteesi ja ominaisuudet   // Nucl . Acids Res. - 1994. - Voi. 22 , ei. 22 . - P. 4810-4817 . doi : 10.1093 / nar/22.22.4810 . — PMID 7984434 .
  49. ↑ Musumeci D., Montesarchio D. Kolesteryyli-HEG-fosforamidiittijohdannaisen synteesi ja sen soveltaminen anti-HIV 5'TGGGAG3' Hotoda's -sekvenssin lipidikonjugaatteihin   // Molecules . - 2012. - Vol. 17 . - P. 12378-12392 . - doi : 10,3390/molekyylit171012378 . — PMID 23090019 . Arkistoitu alkuperäisestä 2. marraskuuta 2015.
  50. ↑ Kayushin A., Demekhina A., Korosteleva M., Miroshnikov A., Azhayev A. Synthesis of biotin-containing phosphoramidite linkker with polyether spacer arm  //  Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. - 2011. - Vol. 30 , ei. 7-8 . - s. 490-502 . doi : 10.1080 / 15257770.2011.587702 . — PMID 21888541 .
  51. ↑ Sproat B., Colonna F., Mullah B., Tsou D., Andrus A., Hampel A., Vinayak R. Tehokas menetelmä oligoribonukleotidien eristämiseksi ja puhdistamiseksi  //  Nucleosides and Nucleotides. - 1995. - Voi. 14 , ei. 1-2 . - s. 255-273 . - doi : 10.1080/15257779508014668 .
  52. ↑ Welz R., Müller S. 5-(bentsyylimerkapto)-1H-tetratsoli 2'-O-TBDMS-fosforamidiitin rakennuspalikoiden aktivaattorina RNA-synteesissä  //  Tetrahedron Lett. - 2002. - Voi. 43 , no. 5 . - s. 795-797 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)02274-2 .
  53. ↑ Vargeese C., Carter J., Yegge J., Krivjansky S., Settle A., Kropp E., Peterson K., Pieken W. Efficient activation of Nucleoside phosphoramidites with 4,5-disyanoimidazole during oligonukleotid synthesis   // Nucl. Acids Res. - 1998. - Voi. 26 , nro. 4 . - s. 1046-1050 . - doi : 10.1093/nar/26.4.1046 . Arkistoitu alkuperäisestä 6. toukokuuta 2022.
  54. ↑ Usman N., Ogilvie KK, Jiang MY, Cedergren RJ Pitkien oligoribunkleotidien automatisoitu kemiallinen synteesi käyttämällä 2'-O-silyloituja ribonukleosidi-3'-O-fosforamidiitteja kontrolloidun huokosen lasikantajalla: samanlaisen 43 nukleotidin sekvenssin synteesi Escherichia colin formyylimetioniini-tRNA:n 3'-puolimolekyyliin // J. Amer. Chem. soc. - 1987. - T. 109 , nro 25 . - S. 7845-7854 . doi : 10.1021 / ja00259a037 .
  55. ↑ Ogilvie KK, Usman N., Nicoghosian K., Cedergren RJ 77 nukleotidin pituisen RNA-sekvenssin kokonaiskemiallinen synteesi, jolla on metioniinin hyväksymisaktiivisuus  // Proc. Natl. Acad. sci. USA. - 1988. - T. 85 , nro 16 . - S. 5764-5768 . - doi : 10.1073/pnas.85.16.5764 . — PMID 3413059 .
  56. ↑ Wu T., Ogilvie KK, Perreault JP, Cedergren RJ Kätevä menetelmä spesifisten seka-DNA-RNA-polymeerien valmistamiseksi // J. Amer. Chem. soc. - 1989. - T. 111 , nro 22 . - S. 8531-8533 . - doi : 10.1021/ja00204a043 .
  57. ↑ Pon RT Parannettu kytkentätehokkuus käyttämällä 4-dimetyyliaminopyridiiniä (DMAP) ja joko tetratsolia, 5-(o-nitrofenyyli)tetratsolia tai 5-(p-nitrofenyyli)tetratsolia oligoribonukleotidien kiinteäfaasisynteesissä fosforamidiittimenetelmällä // Tetrahedron Lett . - 1987. - T. 28 , nro 32 . - S. 3643-3646 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)96344-5 .
  58. ↑ Pon RT, Usman N., Damha MJ, Ogilvie KK Guaniinin modifikaation ja ketjun katkeamisen estäminen oligonukleotidien kiinteäfaasisynteesin aikana käyttämällä fosforamidiittijohdannaisia   ​​// Nucl . Acids Res. - 1986. - Voi. 14 , ei. 16 . - P. 6453-6470 . doi : 10.1093 / nar/14.16.6453 . — PMID 3748816 . Arkistoitu alkuperäisestä 6. toukokuuta 2022.
  59. ↑ Alul RH, Singman CN, Zhang G., Letsinger RL Oxalyl-CPG: labiili tuki herkkien oligonukleotidijohdannaisten synteesille  // Nucl. Acids Res. - 1991. - T. 19 , nro 7 . - S. 1527-1532 . - doi : 10.1093/nar/19.7.1527 . — PMID 2027761 . Arkistoitu alkuperäisestä 6. toukokuuta 2022.
  60. ↑ Uusi tuote : 0,5 M CSO ei-vesipitoiseen hapetukseen DNA-synteesissä  . glenres.com. Käyttöpäivä: 28. tammikuuta 2013. Arkistoitu alkuperäisestä 4. helmikuuta 2013.
  61. ↑ BioAutomaatio. DNA/RNA-oligonukleotidisyntetisaattori: MerMade 384 (linkki ei saatavilla) . Haettu 3. joulukuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 30. syyskuuta 2011. 
  62. ↑ 1 2 3 Guzaev AP, Pon RT Nukleosidien ja muiden linkkereiden kiinnittäminen oligonukleotidisynteesin kiinteän faasin kantajiin // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry . Wiley, 2013.
  63. ↑ 1 2 3 Pon RT Kiinteän faasin tukivälineet oligonukleotidisynteesiin // Nukleiinihappokemian nykyiset protokollat. - Wiley, 2001.
  64. ↑ 1 2 Vaijayanthi B., Kumar P., Ghosh PK, Gupta KC Viimeaikaiset edistysaskeleet oligonukleotidisynteesissä ja niiden sovellukset  //  Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. - 2003. - Voi. 40 , ei. 6 . - s. 377-391 . — PMID 22900365 . Arkistoitu alkuperäisestä 14. elokuuta 2017.
  65. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. Konformationaalisesti esiorganisoitu universaali kiinteä tuki tehokkaalle oligonukleotidisynteesille  //  J. Am. Chem. soc. - 2003. - Voi. 125 , nro. 9 . - P. 2380-2381 . - doi : 10.1021/ja0284613 . — PMID 12603111 .
  66. ↑ Petrie CR, Reed MW, Adams AD, Meyer Jr. RB Parannettu CPG-tuki 3'-amiinipyrstöoligonukleotidien synteesiä varten  //  Bioconjugate Chem. - 1992. - Voi. 3 , ei. 1 . - s. 85-87 . - doi : 10.1021/bc00013a014 . — PMID 1616954 .
  67. ↑ Linkkitekniikat. 3'-Thiol Modifier C3 SS CPG (linkki ei saatavilla) . Käyttöpäivä: 4. joulukuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 29. kesäkuuta 2013. 
  68. ↑ Lumiprobe. Black Hole 1 (BHQ-1) sammuttaja CPG (linkki ei saatavilla) . Käyttöpäivä: 4. joulukuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 23. marraskuuta 2010. 
  69. ↑ Wilk A., Grajkowski A., Phillips LR, Beaucage SL Deoksiribonukleosidisykliset N-asyylifosforamidiitit uutena monomeerien luokana oligotymidylyyli- ja oligodeoksisytidylyylifosforomeerien stereokontrolloidussa synteesissä //Jojotiomeerit. Chem. soc. - 2000. - T. 122 , nro 10 . - S. 2149-2156 . doi : 10.1021 / ja991773u .
  70. ↑ Lebedev AV, Wickstrom E. P-substituoitujen oligonukleotidien kiraalisuusongelma  //  Perspectives in Drug Discovery and Design. - 1996. - Voi. 4 , ei. 1 . - s. 17-40 . - doi : 10.1007/BF02172106 .
  71. ↑ 1 2 Guzaev AP 3H-1,2,4-ditiatsoli-3-tionien ja 3H-1,2-ditioli-3-tionien reaktiivisuus oligonukleotidisynteesin rikitysaineina  (englanniksi)  // Tetrahedron Lett. - 2011. - Vol. 52 , no. 3 . - s. 434-437 . - doi : 10.1016/j.tetlet.2010.11.086 .
  72. ↑ Iyer RP, Egan W., Regan JB, Beaucage SL 3H-1,2-bentsoditioli-3-oni 1,1-dioksidi parannettuina rikinpoistoreagenssina oligodeoksiribonukleosidifosforotioaattien kiinteäfaasisynteesissä  //  J .Am. Chem. soc. - 1990. - Voi. 112 , no. 3 . - s. 1253-1254 . - doi : 10.1021/ja00159a059 .
  73. ↑ Vu H., Hirschbein BL Nukleotidien välinen fosfiittisulfurointi tetraetyylitiuraamidisulfidilla. Fosforotioaattioligonukleotidisynteesi fosforamidiittikemian kautta  (englanniksi)  // Tetrahedron Lett. - 1991. - Voi. 32 , ei. 26 . - s. 3005-3008 . - doi : 10.1016/0040-4039(91)80672-S .
  74. ↑ Efimov VA, Kalinkina AL, Chakhmakhcheva OG, Hill TS, Jayaraman K. Uudet tehokkaat sulfurointireagenssit oligodeoksiribonukleotidifosforotioaattianalogien valmistukseen (ut) // Nucl. Acids Res. - 1995. - T. 23 , nro 20 . - S. 4029-4033 . doi : 10.1093 / nar/23.20.4029 . — PMID 7479060 .
  75. ↑ Ito H., Ike Y., Ikuta S., Itakura K. Solid phase synthesis of polynukleotides. VI. Lisätutkimukset polystyreenikopolymeereistä kiinteälle alustalle   // Nucl . Acids Res. - 1982. - Voi. 10 , ei. 5 . - s. 1755-1769 . doi : 10.1093 / nar/10.5.1755 .
  76. ↑ Tanaka T., Letsinger RL Ruiskumenetelmä oligonukleotidien vaiheittaiseen kemialliseen synteesiin   // Nucl . Acids Res. - 1982. - Voi. 10 , ei. 10 . - P. 3249-3259 . doi : 10.1093 / nar/10.10.3249 . — PMID 7099961 . Arkistoitu alkuperäisestä 6. toukokuuta 2022.
  77. ↑ Alvarado-Urbina G., Sathe GM, Liu WC, Gillen MF, Duck PD, Bender R., Ogilvie KK Geenifragmenttien automatisoitu synteesi   // Tiede . - 1981. - Voi. 214 , nro. 4518 . - s. 270-274 . - doi : 10.1126/tiede.6169150 .
  78. ↑ BioAutomaatio. DNA/RNA-oligonukleotidisyntetisaattori: MerMade . Käyttöpäivä: 11. joulukuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 16. tammikuuta 2013.
  79. ↑ BIOSSET (pääsemätön linkki) . Haettu 11. joulukuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 3. marraskuuta 2012. 
  80. ↑ Azco Biotech Inc. Azco DNA/RNA -syntetisaattorit (linkki ei saatavilla) . Haettu 11. joulukuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 15. syyskuuta 2011. 
  81. ↑ Boal JH, Wilk A., Harindranath N., Max EE, Kempe T., Beaucage SL Oligodeoksiribonukleotidien pilkkominen kontrolloitujen huokosten lasialustoista ja niiden nopea suojauksen poistaminen kaasumaisilla amiineilla   // Nucl . Acids Res. - 1996. - Voi. 24 , nro. 15 . - P. 3115-3117 . doi : 10.1093 / nar/24.15.3115 . Arkistoitu alkuperäisestä 20. tammikuuta 2016.
  82. ↑ Westman E., Strömberg R. T-butyylidimetyylisilyylisuojan poistaminen RNA-synteesissä. Trietyyliamiinitrihydrofluoridi (TEA, 3HF) on luotettavampi vaihtoehto tetrabutyyliammoniumfluoridille (TBAF  )  // Nucl. Acids Res. - 1994. - Voi. 22 , ei. 12 . - P. 2430-2431 . - doi : 10.1093/nar/22.12.2430 . — PMID 7518583 .
  83. ↑ Capaldi DC, Gaus H., Krotz AH, Arnold J., Carty RL, Moore MN, Scozzari AN, Lowery K., Cole DL, Ravikumar VT Synthesis of High-Quality Antisense Drugs. Akryylinitriilin lisääminen fosforotioaattioligonukleotideihin: additioiden karakterisointi ja välttäminen   // Org . Proc. Res. kehittäjä - 2003. - Voi. 7 , ei. 6 . - s. 832-838 . - doi : 10.1021/op020090n .
  84. ↑ Glen Research. Suojauksen poisto - osa 5 - Oligonukleotidien suojauksen poisto pylväässä orgaanisissa liuottimissa . Käyttöpäivä: 11. joulukuuta 2012. Arkistoitu alkuperäisestä 16. tammikuuta 2013.
  85. ↑ Sovellettavat biosysteemit. Synteettisten oligonukleotidien arviointi ja eristäminen. Täydellinen opas (2002). Haettu 15. huhtikuuta 2013. Arkistoitu alkuperäisestä 19. huhtikuuta 2013.
  86. ↑ Synteettisten oligonukleotidien arviointi ja eristäminen, 2002 , pp. 2-5-2-6.
  87. ↑ Synteettisten oligonukleotidien arviointi ja eristäminen, 2002 , pp. 3-1-3-19.
  88. ↑ Synteettisten oligonukleotidien arviointi ja eristäminen, 2002 , pp. 4-1-4-15.
  89. ↑ Krotz AH, Gaus H., Hardee GE Oligonukleotidiadduktien muodostuminen farmaseuttisissa formulaatioissa // Farmaseuttinen kehitys ja teknologia. - 2005. - T. 10 , nro 2 . - S. 283-90 . - doi : 10.1081/PDT-54464 . — PMID 15926677 .
  90. ↑ Willems A., Deforce DL, Van Bocxlaer J. Oligonukleotidien analyysi kapillaarivyöhykeelektroforeesilla ja sähkösumutusmassaspektrometrialla // Methods in Molecular Biology. - Springer, 2008. - T. 384. Kapillaarielektroforeesi. - S. 401-414. — ISBN 978-1-59745-376-9 . - doi : 10.1007/978-1-59745-376-9_14 .

Kirjallisuus

Tärkeimmät alkuperäisteokset

  • Caruthers MH DNA:n ja DNA-analogien kemiallinen synteesi   // Acc . Chem. Res. - 1991. - Voi. 24 , nro. 9 . - s. 278-284 . doi : 10.1021 / ar00009a005 .
  • Letsinger RL, Mahadevan V. Oligodeoksiribonukleotidien vaiheittainen synteesi liukenemattomalla polymeerikantajalla  //  J. Am. Chem. soc. - 1966. - Voi. 88 , no. 22 . - P. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.

Arvostelut

  • Burtscher H., Berner S., Seibl R., Mühlegger K. Nucleic Acids // Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. - Wiley, 2000. - doi : 10.1002/14356007.a18_001 .
  • Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Oligonukleotidisynteesi // Comprehensive Natural Products Chemistry . - Elsevier, 1999. - P. 105-152.
  • Reese CB Oligo- ja polynukleotidit: 50 vuotta kemiallista synteesiä   // Org . Biomol. Chem. - 2005. - Voi. 3 , ei. 21 . - P. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .

Menetelmät

Linkit