Circular RNA ( eng. Circular RNA, circRNA ) on eräänlainen RNA - molekyylejä , joiden päät on suljettu toisiinsa käyttämällä kovalenttista sidosta terminaalisten nukleotidien välillä . CircRNA:ita voidaan muodostaa introneista tai kypsyvän transkriptin eri alueilta . Vaikka pyöreät RNA:t luokitellaan yleensä ei-koodaaviksi RNA:iksi , nyt kerääntyy näyttöä siitä, että ne voivat koodata peptidejä [1] . Pyöreän RNA:n spesifisiä toimintoja ei täysin ymmärretä, mutta ne ovat todennäköisesti mukana geeniekspression säätelyssä . Sirkulaarisia RNA:ita on erityisen runsaasti aivoissa ja ne kiertävät vapaasti veriplasmassa . Ehkä tulevaisuudessa ympyrämäisiä RNA:ita käytetään biomarkkereina eri syöpätyypeille .
Teoriassa cRNA:ta voidaan saada kolmella eri tavalla. Ensinnäkin silmukoinnin aikana intronit poistetaan kypsyvästä transkriptistä ei lineaarisena fragmenttina, vaan lassona. Jos leikkaat "häntä" tästä lassosta, saat pyöreän RNA:n. Tällaiset introniset pyöreät molekyylit kerääntyvät pääasiassa ytimeen ja niitä kutsutaan ciRNA:ksi ( englanninkielisestä ympyränmuotoisesta intronisesta pitkästä ei-koodaavasta RNA: sta ). Toiseksi kypsyvässä transkriptiossa yksittäiset eksonit voivat kiertää ulos, ja sellaiset silmukat voidaan leikata silmukan avulla ja sulkea kovalenttisesti renkaaksi. Näin muodostuu pyöreitä RNA:ita, jotka koostuvat vain yhdestä eksonista. Pyöreät RNA:t, jotka koostuvat yksinomaan eksoneista - yhdestä tai useammasta, on ryhmitelty ecircRNA-ryhmään ( englanninkielisistä eksonisista circRNA :ista ) ja niitä löytyy yleensä sytoplasmasta . Kolmanneksi alue, joka sisältää useita introneita ja eksoneja, voi muodostaa silmukan. Kun silmukka leikataan ja suljetaan silmukoilla, muodostuu pyöreitä RNA:ita, jotka sisältävät sekä eksoneja että introneita. Ne sijaitsevat pääasiassa tumassa, ja niitä kutsutaan EIciRNA:ksi ( englanninkielisestä eksonintroni-circRNA:sta ). Nämä molekyylit voivat jatkaa silmukointia, ja intronien poistamisen jälkeen ne tuottavat ympyrämäisiä RNA:ita, jotka koostuvat useista eksoneista [2] .
Transkription silmukkaosien silmukoiden silmukoiden leikkausprosessia kutsutaan backsplicingiksi . Usein yhtä eksonia ympäröivät intronit sisältävät toisiaan täydentäviä käänteisiä -toistoja , jotka muodostaen vetysidoksia muodostavat silmukan "varren". Silmukka voi tapahtua erityisten proteiinien osallistuessa : tällaisen proteiinin kaksi monomeeriä sitoutuvat tulevan silmukan kahteen päähän, dimerisoituvat ja tuovat päät yhteen niin, että silmukointi voi silloittaa ne kovalenttisesti. Toistaiseksi tunnetaan kolme proteiinia, jotka säätelevät tiettyjen ympyrämäisten RNA:iden muodostumista: Quaking (QKI), Muscleblind (Mbl/MBNL1-3) ja Fusedinsarcoma ( FUS ). Siten Muscleblind säätelee oman geeninsä sircRNA:n muodostumista sitoutumalla spesifisiin kohtiin epäkypsän transkriptin introneissa. Lisäksi sircRNA:n muodostuminen on riippuvainen proteiineista, jotka sitoutuvat kypsymättömään mRNA:han cRNA-leikkauskohdissa, jolloin ne eivät pääse silmukointiin. Yhteenvetona voidaan sanoa, että cRNA:n biogeneesi on monimutkainen prosessi, jota säätelee monien tekijöiden yhdistelmä, mukaan lukien käänteisten toistojen sijainti ja vuorovaikutus proteiinien kanssa, jotka välittävät silmukkaa tai päinvastoin tekevät takaisinsilmukoinnin mahdottomaksi [2] .
Mielenkiintoista on, että joissakin arkeissa rRNA :n muodostuminen etenee pyöreän esiastemolekyylin vaiheen kautta, joka sitten leikataan yksittäisiksi rRNA:iksi [3] .
cRNA- synteesin taso vaihtelee solutyypistä riippuen . Keskimäärin 5–20 % aktiivisista geeneistä havaitaan vastaavat pyöreät RNA:t, ja yksittäinen solu sisältää samanaikaisesti 5000–25 000 sircRNA:ta. Ne muodostavat kuitenkin hyvin pienen osan transkriptomista : harvoja poikkeuksia lukuun ottamatta sircRNA:t muodostavat 5–10 % samasta geenistä syntetisoitujen lineaaristen lähetti-RNA:iden määrästä. Pääsääntöisesti yhdestä geenistä transkriptoi useita ympyrän muotoisia RNA-isoformeja, ja useimmiten geenin toinen eksoni sisältyy sirkRNA:han, kun taas ensimmäinen ja viimeinen eksoni eivät lähes koskaan jää ympyrämuotoon. Jonkin toisen isoformin muodostumista voidaan säädellä. CircRNA-synteesin taso vaihtelee yleensä suuresti solujen erilaistumisen aikana , mutta yleensä kestää useita päiviä tai jopa viikkoja, ennen kuin se muuttuu merkittävästi [2] .
Ilman vapaita päitä, pyöreät RNA:t eivät voi hajota eksonukleaasientsyymeillä , jotka hajottavat monia transkriptejä terminaalisten nukleotidien jatkuvalla pilkkoutumisella. Tässä suhteessa keskimääräinen pyöreä RNA on vakaampi kuin lineaarinen mRNA: circRNA elää 19–24 tuntia (joskus jopa 48 tuntia), mikä on 2–5 (jopa 10) kertaa pidempi kuin lineaaristen molekyylien elinikä. On olemassa useita hypoteeseja siitä, kuinka pyöreät RNA:t hajoavat. Pyöreät RNA:t voivat pilkkoa endonukleaaseja , jotka eivät tuhoa nukleiinihappoja päistä, vaan aiheuttavat katkoksia molekyylin sisäosiin. Luultavasti tässä tapauksessa kompleksi, joka sisältää miRNA :ita , jotka "indusoivat" Argonaute -ryhmän endonukleaaseja kohdemolekyyleihin, on vastuussa tuhoutumisesta. Hajottavissa sircRNA:issa jotkin adenosiinitähteet voivat olla spesifisesti metyloituja . Tällaiset metyloidut RNA:t tunnistavat erityiset proteiinit, jotka siirtävät ne ribonukleiinihappojen hajoamiskohtiin - niin kutsuttuihin P-kappaleisiin . SirkRNA:n tuhoutumiseen voivat osallistua erityiset organellit - autofagosomit , jotka sisältävät muun muassa endonukleaaseja. Solut voivat vapauttaa ylimääräistä circRNA:ta vereen osana solunulkoisia rakkuloita . Jos ensimmäiselle hypoteettiselle reitille pyöreän RNA:n tuhoamiseksi on olemassa joitain kokeellisia vahvistuksia, loput mallit odottavat edelleen kokeellista vahvistusta [2] .
Sekä itse pyöreän RNA:n biologiset vaikutukset että niiden muodostumisprosessi kuvataan. Lisäksi pyöreät RNA:t voivat koodata peptidejä, jotka myös suorittavat tiettyjä solutoimintoja. Vaikka circRNA:n muodostumiseen johtava takaisinsilmukointi on 100 kertaa harvinaisempaa kuin tavallinen lineaarinen silmukointi, on todennäköistä, että nämä kaksi prosessia kilpailevat keskenään ja ovat toisiaan vaimenevia. On mahdollista, että lineaarisen silmukoinnin estäminen pyöreän RNA:iden muodostumisen aikana on näiden molekyylien tärkein solutoiminto. Silmukka pois epäkypsästä transkriptioalueesta johtuen introneissa olevien käänteisten toistojen komplementaarisesta sitoutumisesta voi sinänsä tehokkaasti tukahduttaa lineaarista silmukointia. Lisäksi sekä backsplicing että lineaarinen silmukointi vaativat samat transkriptin alueet; yleensä ne ovat mukana lineaarisessa prosessissa, joka useimmissa tapauksissa estää takaisinliitoksen. On todellakin osoitettu, että sirkulaariset RNA:t ja tavalliset lineaariset mRNA:t samasta geenistä eivät syntetisoidu samanaikaisesti. Kokeelliset todisteet viittaavat kuitenkin monimutkaisempaan suhteeseen lineaarisen ja takaisinliitoksen välillä kuin perinteinen kilpailuvaimennus. On mahdollista, että transkription nopeudella voi olla tärkeä rooli, jossa RNA luetaan geenistä - mRNA tai sirkulaarinen. Siten vaihtoehtoinen silmukointi johtaa usein lassoa sisältävien intronien (eli mahdollisten pyöreän RNA:n esiasteiden) muodostumiseen, ja tämä tapahtuu usein, kun transkriptiota kiihdytetään. Valinta takaisinliitoksen ja lineaarisen liitoksen välillä voi perustua myös monimutkaisempiin mekanismeihin. Oletetaan esimerkiksi, että ympyrämäinen RNA, joka luetaan mbl-geenistä, ottaa haltuunsa tämän geenin koko proteiinituotteen, Muscleblindin. Tiedetään, että tämä proteiini on välttämätön lineaaristen mbl-mRNA:iden muodostumiselle, joten sitoutumalla siihen ja estämällä sitä toimimasta sirkulaariset mbl-RNA:t (circMbl) estävät lineaaristen "veljiensä" synteesiä. Ei myöskään suljeta pois mahdollisuutta, että ympyrämäiset RNA:t sitoutuvat komplementaarisesti niitä synnyttäneiden geenien alueisiin, eli DNA :han [2] .
Useat kokeet viittaavat siihen, että EIciRNA (eksoni-introni) ja ciRNA (introni) vaikuttavat omien geeniensä transkriptioon stimuloimalla RNA-polymeraasi II :ta . Tutkijat pystyivät saostamaan EIciRNA-kompleksin RNA-polymeraasi II:n kanssa vasta- aineita käyttäen , ja kävi ilmi, että polymeraasin stimuloimiseen tarvitaan toinen komponentti - pieni tuma-RNA U1 . Ehkä U1 sijaitsee vuorovaikutuksessa EIciRNA:n kanssa siten, että se stimuloi polymeraasia. Samaan aikaan ciRNA:t näyttävät pystyvän sitoutumaan suoraan kromatiiniin "emogeenien" alueella ja lisäämään niiden transkription nopeutta. Oli mahdollista saostaa esimerkiksi ci-ankrd52-niminen ciRNA kompleksina aktiivisesti toimivan RNA-polymeraasi II:n kanssa (entsyymin aktiivinen muoto erottuu C-terminaalisen domeenin erityisestä fosforylaatiosta ). Koska ciRNA:t voivat sitoutua myös "vieraisiin" DNA-sekvensseihin, niiden rooli geeniekspression säätelyssä voi olla merkittävä [2] .
Kahden ecircRNA:n (eksoninen, paikallinen sytoplasmaan) kyky vaikuttaa proteiinisynteesiin on osoitettu kokeellisesti . circANRIL hajottaa rRNA:ta prosessoivien proteiinien kompleksin vähentäen siten toiminnallisten ribosomien määrää ja proteiinisaantoa. Samanaikaisesti circPABPN1 vaimentaa HuR -proteiinin työtä , joka on välttämätön useiden mRNA:iden translaatiolle [2] .
Pyöreät RNA:t voivat toimia rakenteellisena perustana proteiinikompleksien kokoamiselle ja siten tarjota proteiinien välisiä vuorovaikutuksia . Esimerkiksi circ-Foxo3:n kautta sykliinistä riippuvainen kinaasi 2 (Cdk2) on vuorovaikutuksessa estäjänsä p21 :n kanssa , mikä johtaa solusyklin pysähtymiseen . Lisäksi pyöreät RNA:t voivat eristää proteiineja ja rajoittaa niiden liikkumista työhön. Siten edellä mainittu circ-Foxo3 voi "lukita" transkriptiotekijän E2F1 ja joitain muita proteiineja sytoplasmassa [3] .
Jotkut eksoniset pyöreät RNA:t sisältävät sitoutumiskohtia geeniekspression negatiivisille säätelijöille, mikroRNA:ille. Englanninkielisessä kirjallisuudessa tällaisia sircRNA:ita kutsutaan usein mikroRNA-sieniksi tai sieniksi, jotka absorboivat mikroRNA:ita. Niihin sitoutumalla mikroRNA:t eivät voi enää olla vuorovaikutuksessa komplementaaristen kohde-mRNA:iden kanssa ja häiritä niiden translaatiota. Esimerkiksi CDR1as-cRNA sisältää 74 miR-7-mikroRNA-sitoutumiskohtaa ja Sry -geenistä luettu hiiren cRNA (tärkeä sukupuolen määrittämisen kannalta ) sisältää 16 miR-138-sitoutumiskohtaa. On kuitenkin huomattava, että vain muutaman pyöreän RNA:n on osoitettu sitoutuvan mikroRNA:ihin, eli tämä on pikemminkin poikkeus kuin sääntö. Mielenkiintoista on, että sircRNA:ita on löydetty joistakin yksisoluisista eukaryooteista , joilla ei ole lainkaan mikroRNA:ita, nimittäin hiivasta Saccharomyces cerevisiae ja malariaplasmodium Plasmodium falciparum . Siten sitoutuminen mikroRNA:ihin ei voi olla sirkulaaristen RNA:iden päätehtävä [2] .
Useilla pyöreillä RNA:illa on tärkeä rooli virustenvastaisessa immuniteetissa . Esimerkiksi kanat , jotka ovat resistenttejä lintuleukemiavirukselle , tuottavat 12 sircRNA:ta suurempia määriä kuin normaalit kanat. Monet näistä molekyyleistä sitoutuvat mikroRNA:ihin, jotka säätelevät immuuniprosesseihin, kuten B-lymfosyyttien aktivaatioon ja antigeenin esittelyyn liittyvien geenien ilmentymistä . Kummallista kyllä, immuunijärjestelmä vaikuttaa myös pyöreän RNA:n synteesiin. Esimerkiksi immuunitekijät NF90 ja NF110 ( ILF3 -geenin silmukointivariantit ) stimuloivat sircRNA:n muodostumista kypsyvästä transkriptistä tumassa. Virusinfektion olosuhteissa nämä proteiinit menevät sytoplasmaan, jossa ne sitoutuvat viruksen mRNA:han ja estävät viruksen elinkaarta ; tuman sircRNA:n määrä vähenee, mikä voi moduloida geeniekspressiota. CircRNA:t voivat myös osallistua infektion tukahduttamiseen sitoutumalla virus- tai solumiRNA:ihin, jotka häiritsevät immuunivastetta [3] .
Tiedetään, että useimpiin takaisinsilmukointitapahtumiin liittyy eksoneja ja ne tapahtuvat proteiinia koodaavien geenien RNA:ssa. Useimpien mRNA:iden translaatio alkaa siten, että ribosomi tunnistaa muunnetun nukleotidin mRNA:n 5'-päässä, niin kutsutussa capssa . CircRNA:illa ei ole vapaata 5'-päätä, joten niillä ei voi olla korkkia. Jotkut solu- ja virus-RNA:t voidaan kuitenkin transloida ilman korkkia erityissekvenssin - IRES - osallistumisen avulla . Sama voisi tapahtua ympyrämäisten RNA:iden kanssa [2] [3] .
Itse asiassa keinotekoiset sircRNA:t, jotka sisältävät IRES:n ja koodaavat jotain peptidiä, voitaisiin transloida. On kuitenkin osoitettu, että suurin osa elävien solujen pyöreistä RNA:ista ei liity ribosomeihin, joten niiden translaatio ei todennäköisesti ole laajalle levinnyt. Toistaiseksi tunnetaan kaksi pyöreää RNA:ta, jotka todennäköisesti syntetisoivat proteiineja in vivo , nämä ovat circMbl ja circZNF609. On syytä huomata, että nämä molekyylit muodostuvat jossain määrin epästandardeja: ensimmäisessä tapauksessa takaisinsilmukointi vaikuttaa ensimmäiseen eksoniin, joka, kuten muistamme, ei yleensä sisälly pyöreisiin RNA: ihin, ja toisessa tapauksessa 5': n fragmentti. -alkuperäisen transkriptin transloimaton alue siirtyy circRNA:han, jolla on ominaisuudet IRES. On mahdollista, että proteiinisynteesi sircRNA:lla on mahdollista vain erityisissä olosuhteissa, esimerkiksi stressissä - lämpösokissa tai nälkään [2] .
Jos oletetaan, että jokin pyöreä RNA sisältää avoimen lukukehyksen, jossa on nukleotidien lukumäärä, joka on kolmen kerrannainen, niin teoriassa tällaisen RNA:n translaatio voi edetä pyörivän rengasmekanismin mukaisesti . Tällaisen translaation tulos olisi teoriassa toistuvien aminohappolohkojen loputon ketju , ja sen kasvua rajoittaisi ribosomien prosessiokyky . Samanlaisia tapauksia ei vielä tunneta solujen cRNA:ista, mutta jotain samanlaista tapahtuu riisin keltapilkkuvirukseen liittyvän viroidi- cRNA :n kanssa [2] .
Viimeaikaiset edistysaskeleet cRNA:n havaitsemisessa johtuvat RNA-sekvensointiteknologian parannuksista , kuten yksittäisten lukujen pituuden pidentämisestä RNA:n sovittamisen algoritmien parantamisesta tunnettujen geenien kanssa ja RNA - kirjastojen laajentamisesta Pyöreät RNA:t voidaan erottaa lineaarisista RNA:ista käyttämällä bioinformatiikkaa (sekvensointitulosten perusteella) tai "märkää" menetelmää, jossa käytetään eksonukleaaseja. Kuten edellä mainittiin, nämä entsyymit pilkkovat nopeasti lineaarisia RNA:ita, mutta jättävät ympyränmuotoiset RNA:t ennalleen. Tuhansia pyöreitä RNA:ita on tunnistettu käyttämällä eksonukleaaseja, mutta suurin osa sircRNA:ista on kuvattu korkean suorituskyvyn sekvensoinnin ansiosta erityisalgoritmeilla [4] .
Tällä hetkellä on olemassa useita pyöreälle RNA:lle omistettuja tietokantoja ja online-työkaluja niiden kanssa työskentelemiseen. Heidän joukossaan [5] :
Pyöreitä RNA:ita löytyy eri määrinä veriplasmassa, ja ääreisveressä niitä on jopa enemmän kuin elinsoluissa . Syyt tähän eivät ole selviä, varsinkin kun otetaan huomioon se tosiasia, että 25 %:ssa seerumia circRNA:t hajoavat jo 30 sekunnissa (keskimääräinen pyöreä RNA on olemassa solussa 1-2 päivää). Oli miten oli, tiettyjen pyöreiden RNA:iden läsnäolo ja määrä veriplasmassa voi toimia tärkeänä kehon terveyden indikaattorina. Toisin sanoen cRNA:ita voidaan käyttää biomarkkereina patologioiden , kuten sepelvaltimotaudin , erityyppisten syöpien (mukaan lukien leukemia ), diabeteksen ja multippeliskleroosin , diagnosoinnissa ja vaiheittamisessa [2] .
Jotkut pyöreät RNA:t liittyvät solujen vanhenemiseen . Siten circPVT1 toimii proliferoituvien fibroblastien ikääntymisen estäjänä [4] . Useat pyöreät RNA:t liittyvät ikääntymiseen liittyviin muutoksiin kehossa: esimerkiksi apinoiden lihasten ikääntymiseen liittyviä molekyylejä on tunnistettu [6] .
Tähän mennessä 10 pyöreän RNA:n tiedetään osallistuvan sydän- ja verisuonisairauksien ja aineenvaihduntasairauksien (esimerkiksi diabetes mellituksen) kehittymiseen. Jo mainittu circANRIL voi suojata ateroskleroosilta estämällä rRNA:n kypsymistä ja siten estämällä solujen jakautumista , jonka liiallinen lisääntyminen johtaa ateroskleroottisten plakkien muodostumiseen . MICRA-niminen pyöreä RNA voi merkitä sydäninfarktin aiheuttamaa vasemman kammion toimintahäiriötä . Sydämen hypertrofian ja sydämen vajaatoiminnan yhteydessä havaitaan useiden pyöreän RNA:iden synteesin vähenemistä [2] .
Joidenkin solujen RNA:iden on osoitettu liittyvän diabetes mellitukseen. Tiedetään, että miR-7-mikroRNA:n ylituotanto haiman β-soluissa edistää diabeteksen kehittymistä, kun taas miR-7:ää sitovan pyöreän RNA:n ciRS -7:n ylituotanto näissä soluissa päinvastoin parantaa insuliinin eritystä . 4] .
Erilaisten organismien hermokudoksissa ( hedelmäkärpäsistä ihmisiin) löytyy erityisen paljon pyöreitä RNA:ita. Ehkä tämä johtuu vaihtoehtoisen silmukoinnin yleisyydestä hermosoluissa . Lisäksi niissä olevat pyöreät RNA:t voivat suorittaa erityistoimintoja, jotka liittyvät hermoimpulssien johtamiseen . Qki -proteiini , joka osallistuu siru-RNA:n muodostukseen, osallistuu oligodendrosyyttien kehitykseen ja säätelee myelinaatiota sekä estää dendriittien muodostumista keskushermostossa . Tämän proteiinin geenin mutaatiot liittyvät ataksiaan ja skitsofreniaan [2] . On myös näyttöä sirkulaaristen RNA:iden yhteydestä Alzheimerin tautiin [4] [6] .
Yli 20 cRNA:ta on yhdistetty erilaisten syöpien, kuten paksusuolen- , munasarja- , virtsarakon- , rinta- , maksa- , maha- , munuais- ja eturauhassyöpien , kehittymiseen . Onkologisiin prosesseihin liittyy usein translokaatioita , jotka johtavat kasvainspesifisten sircRNA-lajien ilmaantumiseen. Useimmiten syöpään liittyvät cRNA:t toimivat miRNA:iden sieninä [2] .