Vaihtoehtoinen silmukointi on lähetti-RNA :n (mRNA) silmukoinnin variantti, jossa geeniekspression aikana muodostuu useita kypsiä mRNA:ita, jotka perustuvat samaan primääriseen transkriptiin (pre-mRNA). Rakenteellisia ja toiminnallisia eroja syntyneissä transkripteissä voi aiheuttaa sekä primäärisen transkriptin eksonien selektiivinen sisällyttäminen kypsään mRNA:han että intronien osien säilyminen siinä [1] [2] . Yleisin vaihtoehtoinen silmukoiminen sisältää eksonien ohituksen : transkriptin yksittäiset eksonit voidaan tietyissä olosuhteissa joko sisällyttää kypsään mRNA:han tai ohittaa [3] .
Tällaisten mRNA:iden translaatiolla tuotetut proteiinit johtavat erilaisiin aminohapposekvensseihin ; siten vaihtoehtoisessa silmukointissa yksi transkripti varmistaa useiden proteiinien synteesin. Tällaisen silmukoinnin yleinen esiintyminen eukaryooteissa johtaa niiden genomissa koodattujen proteiinien monimuotoisuuden merkittävään lisääntymiseen [4] . Esimerkiksi ihmiskeho syntetisoi vähintään 100 tuhatta erilaista proteiinia, kun taas niitä koodaavia geenejä on noin 20 tuhatta (yli 75 % kaikista ihmisen introneja sisältävistä geeneistä toimii templaatteina pre-mRNA:n synteesiin, jotka ovat muita vaihtoehtoisia liitoksia) [1] [2] .
Vaihtoehtoisesti silmukoituneiden mRNA:iden muodostumista ohjaa trans -toimivien proteiinien järjestelmä ( silmukointitekijät ), jotka sitoutuvat ensisijaisen transkriptin cis - kohtiin . Silmukointitekijöistä erotetaan silmukointiaktivaattorit ja repressorit : ensimmäiset edistävät yksittäisten kohtiensa käyttöä, kun taas jälkimmäiset päinvastoin estävät niiden käyttöä. Vaihtoehtoisen silmukoinnin mekanismit ovat hyvin erilaisia, "silmukointikoodin" tunteminen mahdollistaa tietyn geenin silmukoinnin tulosten ennustamisen tietyissä olosuhteissa [5] [6] .
Vaihtoehtoiset silmukointihäiriöt johtavat usein sairauksiin; monet ihmisen geneettiset sairaudet johtuvat näistä poikkeavuuksista [5] . Tutkijat uskovat, että poikkeava silmukointi voi edistää syövän kehittymistä , ja on osoitettu, että erityyppisissä syövissä silmukointitekijägeenit usein mutatoituvat , mikä johtaa silmukoinnin normaalin kulun häiriintymiseen [7] [8] [9] [ 10] . On myös osoitettu, että vaihtoehtoiset silmukointihäiriöt edistävät kehon vastustuskyvyn kehittymistä kemoterapiaa vastaan [11] .
Vaihtoehtoinen silmukointi kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1977 adenoviruksissa [12] [13] . Adenoviruksen on havaittu tuottavan viittä erilaista transkriptiä infektiosyklin varhaisessa vaiheessa , ennen viruksen DNA :n replikaatiota , ja vielä yhtä DNA:n replikaation alkamisen jälkeen; kun taas varhaisten primääristen transkriptien muodostuminen jatkuu DNA:n replikaation alkamisen jälkeen. Ylimääräinen yksittäinen transkripti, joka muodostuu infektiosyklin myöhemmissä vaiheissa, luetaan 5/6:sta 32 kb:n adenovirusgenomista. Myöhäinen transkripti on paljon pidempi kuin kumpikaan varhainen viruskopio. Tutkijat osoittivat, että adenoviruksen tyypin 2 tuottama primaarinen transkripti infektion myöhäisvaiheessa silmukoituu eri tavoin, mikä johtaa eri virusproteiineja koodaavien mRNA:iden muodostumiseen. Lisäksi primääritranskripti sisältää useita polyadenylaatiokohtia , mikä johtaa erilaisiin 3'-päihin eri mRNA:ille [14] [15] [16] .
Vuonna 1981 kuvattiin vaihtoehtoinen silmukointi solun eukaryoottigeenissä. Nisäkässoluissa tällaisen vaihtoehdon on osoitettu liittyvän kalsitoniinihormonin muodostumiseen . Kalsitoniinigeenin primaarinen transkripti sisältää 6 eksonia; kalsitoniinia koodaava kypsä mRNA sisältää eksonit 1-4 ja polyadenylaatiosignaali sijaitsee eksonissa 4. Toisessa samasta primääritranskriptistä muodostuneessa mRNA:ssa eksoni 4 ohitetaan silmukoinnin aikana ja kypsä mRNA sisältää eksonit 1-3, 5, ja 6 Se kalsitoniinigeeniin liittyvä peptidi [ 17 ] [18] . Vaihtoehtoinen silmukointi nisäkkäiden immunoglobuliinigeeneissä löydettiin myös 1980-luvun alussa [14] [19] .
Myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet, että vaihtoehtoinen silmukointi on yleistä kaikissa eukaryooteissa [3] . Samaan aikaan yhdestä geenistä transloitavien proteiini-isoformien määrä voi olla varsin merkittävä. Siten on laskettu, että hedelmäkärpäsen Drosophila melanogasterin geeni , joka tunnetaan nimellä DSCAM , voi itsenäisesti yhdistettynä kaikkien saatavilla olevien eksonien mRNA:han mahdollisesti aikaansaada 38 016 isoformin synteesin [20] .
Vaihtoehtoisia liitosmalleja on viisi [3] [4] [5] [21] [22] :
Vaihtoehtoisen silmukoinnin viiden päämallin lisäksi tunnetaan kaksi menetelmää useiden proteiinien saamiseksi yhdestä geenistä useiden promoottorien ja useiden polyadenylaatiokohtien käytön seurauksena . Useiden promoottorien käyttö liittyy kuitenkin enemmän transkription säätelyyn kuin vaihtoehtoiseen silmukointiin. Aloittamalla transkriptio eri kohdista, on mahdollista saada transkriptejä erilaisilla 5'-pään eksoneilla. Toisaalta useiden polyadenylaatiokohtien käyttö johtaa erilaisten 3'-päiden muodostumiseen kypsymistranskripteissä. Nämä molemmat mekanismit yhdistettynä viiteen silmukointimalliin mahdollistavat samasta geenistä luettujen mRNA:iden monimuotoisuuden [3] [5] .
Yksi transkriptio pystyy käymään läpi useamman kuin yhden tyyppisen vaihtoehtoisen silmukoinnin [22] . Yllä käsitellyt mallit kuvaavat perusliitosmekanismit hyvin, mutta eivät välttämättä sovellu monimutkaisiin tapauksiin. Esimerkiksi oikealla oleva kuva esittää hiiren hyaluronidaasi 3 -geenin kolme silmukoitua muotoa. Ensimmäisen muodon (vihreä) ja toisen (keltainen) eksonien vertailu osoittaa, että introni oli konservoitunut lopullisessa transkriptissa, ja toisen muodon vertailu kolmanteen (sininen) osoittaa eksonien ohittamista [21] .
DNA:sta transkriptoitu pre-mRNA sisältää sekä eksoneja että introneita, ja vaihtoehtoiselle silmukoitumiselle tarvittavan taustan luovien intronien lukumäärä ja pituus vaihtelevat merkittävästi eri eukaryooteissa. Siten intronien keskimäärä yhtä intronia sisältävää geeniä kohden malli-organismeissa on 2,5 Drosophila melanogasterissa , 4,2 Caenorhabditis elegansissa ja 4,8 Arabidopsis thalianassa ; nisäkkäillä se vaihtelee välillä 5,7 - 7,8 [24] . Silmukoinnin aikana eksonit on jätettävä transkriptiin ja intronit poistettava. Silmukointikohtien säätely ja valinta saadaan aikaan trans -vaikuttavien silmukointiaktivaattoriproteiinien ja -repressorien avulla sekä itse pre-mRNA:ssa läsnä olevilla cis-toimivilla elementeillä - silmukoinnin tehostajat ja äänenvaimentimet [ 25] .
Tyypilliset eukaryoottiset intronit sisältävät konsensussekvenssejä ; siten jokaisen intronin 5'-päässä on dinukleotidi GU, 3'-pään vieressä on "haarapiste", jossa nukleotidi A on aina läsnä ja sen ympärillä olevat sekvenssit vaihtelevat . Ihmisillä haarautumispisteen yUnAy ympärillä on konsensussekvenssi [26] . Haaroittumiskohdan jälkeen on sarja pyrimidiinejä ( polypyrimidine tract ), ja intronin 3'-pää näyttää AG :lta [5] .
Pre-mRNA:n silmukointi suoritetaan RNA - proteiinikompleksilla, joka tunnetaan silmukointina . Silmukointi sisältää pieniä tuman ribonukleoproteiineja (snRNP:t), jotka on merkitty U1 , U2 , U4 , U5 ja U6 (U3-ribonukleotidi ei osallistu mRNA:n silmukoitumiseen) [23] ] [27] . Ribonukleotidi U1 sitoutuu 5'-pään dinukleotidiin GU, ja U2 sitoutuu proteiinitekijöiden U2AF mukana haarautumiskohtaan (tässä vaiheessa kompleksia kutsutaan silmukointi-A-kompleksiksi). A-kompleksin muodostumisen aikana määritetään poistetun intronin 5'- ja 3'-rajat sekä eksonien päät, jotka tulisi jättää [5] .
Lisäksi kompleksi U4, U5, U6 sitoutuu A-kompleksiin. Sen jälkeen U6 korvaa U1:n ja U1 ja U4 lähtevät kompleksista. Jäljelle jäävä kompleksi käy läpi kaksi transesteröintireaktiota . Ensimmäisessä reaktiossa intronin 5'-pää katkaistaan päällä olevasta eksonista ja kiinnittyy haarapisteestä nukleotidiin A 2',5'- fosfodiesterisidoksen avulla, minkä seurauksena introni ottaa lasson muodon . Toinen reaktio katkaisee intronin 3'-pään ja yhdistää kaksi eksonia fosfodiesterisidoksella; kun introni vapautuu ja tuhoutuu [3] [23] .
Silmukointia säätelevät trans - aktiiviset proteiinit ( aktivaattorit ja repressorit ) ja vastaavat cis -säätelyelementit ( äänenvaimentimet ja tehostajat ) pre-mRNA:ssa. On kuitenkin näyttöä siitä, että monissa tapauksissa silmukointitekijän toiminta riippuu sen sijainnista: kun silmukointitekijä liittyy intronin tehostajaelementtiin, se toimii silmukoinnin aktivaattorina ja kun se sitoutuu säätelykohtaan eksonissa. , se toimii repressorina [25] . Silmukoinnin säätelyyn liittyy myös pre-mRNA:n sekundaarinen rakenne , joka varmistaa kahden säätelyelementin tehokkaan konvergenssin toistensa kanssa tai peittää ne sekvenssit, jotka voisivat toimia silmukointitekijöiden sitoutumispaikkoina [28] [29] . Yhdessä nämä elementit muodostavat "liitoskoodin", joka määrittää kuinka liitos etenee tietyissä solukkoolosuhteissa [30] [31] .
Pre-mRNA:ssa tunnetaan kahden tyyppisiä cis -aktivoivia elementtejä, ja ne vastaavat trans -aktivoivia RNA:ta sitovia proteiineja. Silmukointivaimentimet ovat elementtejä, joihin vaimennusrepressoriproteiinit sitoutuvat, mikä vähentää todennäköisyyttä, että silmukointikohta on lähistöllä. Silmukoivien äänenvaimentimien sijainti voi olla joko introneja (intronin silmukointivaimentimia, ISS) tai eksoneja (eksonisia silmukointivaimentimia, ESS). Niiden nukleotidisekvenssit sekä niihin sitoutuvat proteiinit ovat hyvin erilaisia. Useimmat silmukointirepressorit ovat heterogeenisiä tuman ribonukleoproteiineja (hnRNP), kuten hnRNPA1 ja polypyrimidiinitraktia sitova proteiini (PTB) [5] [30] .
Silmukoinnin tehostajat sitovat silmukointiaktivaattoriproteiineja, mikä lisää tehokasta todennäköisyyttä, että silmukointikohta on lähellä. Sekä intronit (intronin silmukoinnin tehostajat, ISE) että eksonit (eksonin silmukoinnin tehostajat, ESE) voivat myös toimia isäntänä. Suurin osa ISE:hen ja ESE:hen sitoutuvista proteiineista kuuluu SR -proteiiniperheeseen (säätelee vaihtoehtoisen silmukoinnin kulkua, mutta myös monia muita soluprosesseja [32] ; ensimmäinen tämän perheen proteiineista, tunnistettu silmukointitekijä, löydettiin vuonna 1991 [33] ). Nämä proteiinit sisältävät RNA:n tunnistusmotiiveja sekä runsaasti arginiinia ja seriiniä sisältäviä domeeneja [ 5] [30] .
Siten silmukointitekijät toimivat toisistaan riippuvaisesti ja niiden toiminnan tulokset riippuvat myös ympäristöstä [31] . Tiettyjen cis -säätely-RNA-sekvenssien läsnäolo voi sekä lisätä todennäköisyyttä, että silmukointikohta on lähellä, että vähentää tätä todennäköisyyttä kontekstista riippuen. Esimerkiksi jotkut näistä elementeistä vaikuttavat silmukointiin vain, jos niiden vieressä on muita hyvin määriteltyjä elementtejä. Lisäksi cis -säätelyelementeillä voi olla erilaisia vaikutuksia, kun tiettyjä proteiineja ekspressoituu solussa. Tehostajien ja silmukointivaimentimien adaptiivinen merkitys vahvistetaan tutkimuksilla, jotka osoittavat, että ihmisen geenien mutaatiot, jotka johtavat uusien äänenvaimentimien muodostumiseen tai vanhojen tehostajien tuhoutumiseen, ovat tiukan valinnan kohteena [34] [35] .
Drosophila D. melanogasterin dsx -geenin pre-mRNA sisältää 6 eksonia. Miehillä kypsä mRNA sisältää eksonit 1, 2, 3, 5, 6 ja koodaa proteiinia, joka toimii transkription säätelijänä miestyyppisessä kehityksessä. Naisilla kypsä mRNA sisältää eksonit 1, 2, 3 ja 4, ja eksoni 4 sisältää polyadenylaatiosignaalin, jossa mRNA leikataan. Tuloksena oleva proteiini toimii transkription säätelijänä naarastyyppisessä kehityksessä [36] .
Kuvatussa esimerkissä tapahtuu eksonin ohitustyypin vaihtoehtoinen silmukointi. Eksonista 4 ylävirtaan oleva introni sisältää polypyrimidiinikanavan, joka ei täysin täytä konsensussilmukointisekvenssiä; siksi U2AF-proteiinit sitoutuvat siihen huonosti silmukointiaktivaattoreiden puuttuessa. Tästä syystä tätä 3' silmukoinnin vastaanottajakohtaa ei käytetä miehillä. Naarailla on kuitenkin läsnä silmukointiaktivaattori Transformer (Tra). Tämä proteiini sitoutuu SR-proteiiniin Tra2 (jota tuotetaan molemmissa sukupuolissa ja sitoutuu ESE:hen eksonissa 4) ja yhdessä toisen SR-proteiinin, dsxRE:n, kanssa muodostaa kompleksin, joka helpottaa U2AF-proteiinien sitoutumista heikkoon pyrimidiinikanavaan. U2 värvätään vastaavaan haarakohtaan, mikä johtaa eksonin 4 liittämiseen kypsään mRNA:han [36] [37] .
Vaihtoehtoiset hyväksymissivustot: Drosophila TransformerD. melanogaster Transformer (Tra) -geenin pre-mRNA:t käyvät läpi vaihtoehtoisen silmukoinnin vaihtoehtoisten akseptorikohtien mallin mukaisesti. Tra-geeni koodaa proteiinia, joka ilmentyy vain naisilla. Tämän geenin ensisijainen transkripti sisältää intronin, jossa on kaksi mahdollista akseptorikohtaa. Miehillä ylävirran akseptorikohta on mukana, minkä vuoksi mRNA sisältää eksonin 2 pidennetyn version, joka sisältää ennenaikaisen lopetuskodonin; siksi miehillä muodostuu katkaistu inaktiivinen proteiini. Naaraat sen sijaan tuottavat täydellistä proteiinia, jolla on keskeinen rooli sukupuolen määrittämisessä ja joka tunnetaan nimellä Sex lethal (Sxl). Sxl-proteiini on silmukointirepressori ja sitoutumalla ISS:ään Tra-RNA-transkriptissa lähellä ylävirran akseptorikohtaa, estää U2AF-proteiinin sitoutumisen polypyrimidiinikanavaan; tämän seurauksena silmukointi sitoutuu alavirran akseptorikohtaan, mikä johtaa ennenaikaisen lopetuskodonin poistamiseen. Tuloksena oleva mRNA koodaa Tra-proteiinia, joka itse toimii muiden sukupuoleen liittyvien geenien vaihtoehtoisen silmukoinnin säätelijänä (katso yllä oleva esimerkki dsx -geenistä ) [3] .
Vaihtoehtoinen Fas-reseptorin silmukointiVaihtoehtoinen silmukointi johtaa Fas -reseptorin useiden isoformien synteesiin . Ihmisillä tämän reseptorin kaksi normaalia isoformia muodostuu eksonien ohituksella. 6 eksonia sisältävä mRNA koodaa Fas-reseptorin kalvoon sitoutunutta muotoa, joka stimuloi apoptoosia . Fas-reseptorin lisääntynyt muodostuminen soluissa, jotka ovat jatkuvasti alttiita auringonvalolle, ja tämän reseptorin puuttuminen ihosyöpäsoluista osoittavat, että tarkasteltavana olevalla mekanismilla on tärkeä rooli solujen eliminoinnissa, jotka ovat lähteneet syöpään transformoitumisen tielle [38] . Kun eksoni 6 ohitetaan, muodostuu Fas-proteiinin vesiliukoinen isoformi, joka ei pysty stimuloimaan apoptoosia. Valinta eksonin insertion tai ohituksen välillä riippuu kahden antagonistiproteiinin: TIA-1 ja PTB:n vaikutuksesta.
Luovuttajakohta, joka sijaitsee intronin 5'-päässä eksonin 6 jälkeen pre-mRNA:ssa, on huonosti linjassa konsensussilmukointisekvenssin kanssa, eikä se aina sitoudu snRNP U1:een [5] . Jos U1-sitoutumista ei tapahdu, eksoni 6 ohitetaan (kuva a oikealla olevassa kuvassa). TIA-1-proteiinin sitoutuminen intronin silmukoinnin tehostajaan stabiloi U1:n sitoutumisen. Intronin 5'-päähän muodostunut luovuttajakohta auttaa silmukointitekijää U2AF sitoutumaan eksonin ylävirtaan sijaitsevaan 3'-silmukointikohtaan, vaikka tämän mekanismia ei vielä ymmärretä (kuva b kuvassa oikealla) [39 ] . Exon 6 sisältää runsaasti pyrimidiiniä sisältävän silmukointivaimentimen ( ure6 ), johon PTB voi sitoutua. Jos PTB-sitoutuminen tapahtuu, luovuttajakohta intronin 5'-päässä ei edistä U2AF:n sitoutumista ja eksoni ohitetaan (kuva c oikealla olevassa kuvassa).
Yllä kuvattu mekanismi on esimerkki eksonin määrittelystä silmukoinnin aikana. Silmukointi kokoontuu intronin alueelle ja snRNP taittaa RNA:n siten, että intronin 5'- ja 3'-päät liittyvät yhteen. Kuitenkin yllä kuvatussa tapauksessa eksonin päät ovat myös vuorovaikutuksessa. Tässä tapauksessa tarvitaan vuorovaikutuksia, jotka määrittävät eksonien rajat, jotta ytimen silmukointitekijät sitoutuvat ennen silmukointiosomin kokoamista viereisten intronien rajoihin [39] .
Repressori-aktivaattorikilpailu: HIV-1 :n tat -geenin eksoni 2HIV , AIDS :ia aiheuttava retrovirus , muodostaa yhden pre-mRNA:n, josta sitten muodostuu vaihtoehtoisen silmukoinnin kautta yli 40 erilaista mRNA:ta [40] . Tasapaino eri tavoin silmukoituneiden transkriptien välillä varmistaa mRNA:iden muodostumisen, jotka koodaavat kaikkia viruksen replikaatioon tarvittavia proteiineja [41] . Yksi eri tavalla silmukoiduista transkripteistä sisältää tat -geenin transkriptin , jossa eksoni 2 on kasetti, eli se voidaan joko sisällyttää lopulliseen transkriptiin tai ei. Tämän eksonin sisällyttämistä säätelevät silmukointirepressori hnRNP A1 ja SR-proteiini SC35. Eksonissa 2 äänenvaimenninsekvenssi (ESS) ja tehostinsekvenssi (ESE) menevät päällekkäin. Jos A1-repressori sitoutuu ESS:ään, se laukaisee A1- molekyylien yhteistoiminnallisen sitoutumisen , sulkee 5'-pään luovutuskohdan ylävirtaan eksonista 2 ja estää U2AF35:tä sitoutumasta polypyrimidiinikanavaan. Jos SC35 sitoutuu ESE:hen, se estää A1:tä sitoutumasta ja 5'-luovuttajakohta pysyy silmukoinnin käytettävissä. Repressorin ja aktivaattorin välinen kilpailu johtaa vastaavasti RNA:n muodostumiseen, joka sisältää tai ei sisällä eksoni 2:ta [40] .
Vaihtoehtoinen silmukointi on yksi poikkeuksista sääntöön, jonka mukaan yksi geeni vastaa yhtä proteiinia (hypoteesi "yksi geeni - yksi entsyymi ") [42] . Olisi oikeampaa sanoa: "yksi geeni - monta polypeptidiä ". Ulkopuolista tietoa tarvitaan, jotta voidaan päättää, mikä polypeptidi muodostetaan tietystä mRNA:sta. Koska säätelymenetelmät ovat periytyviä, tämä avaa mutaatioille uuden tavan muuttaa geenien ilmentymistä [9] .
Eukaryooteille vaihtoehtoisen silmukoinnin oletetaan olevan erittäin tärkeä askel kohti geeniekspression tehokkuutta, koska se mahdollistaa tiedon tallentamisen taloudellisemmin. Yksi geeni voi synnyttää useita proteiineja yhden sijaan, joten sama proteomidiversiteetti voidaan saada huomattavasti pienemmästä genomista [3] . Se tarjoaa myös evolutionaarista joustavuutta. Yksittäinen pistemutaatio voi johtaa eksonin sisällyttämiseen tai poissulkemiseen transkriptista, minkä ansiosta voidaan saada uusi proteiini-isoformi menettämättä päämuotoaan [3] . Itse asiassa on löydetty epäjärjestyneitä alueita, jotka sisältävät monia ei-konstitutiivisia eksoneja, joten proteiini-isoformit voivat suorittaa uusia toimintoja muuttamalla toiminnallisia moduuleja näissä paikoissa [43] [44] [45] . Vertailevat arviot osoittavat, että vaihtoehtoisen silmukoinnin ilmaantuminen evoluution aikana edelsi monisoluisuuden syntymistä; ehdottavat, että vaihtoehtoinen silmukointi oli yksi keino, joka varmisti monisoluisten organismien syntymisen [46] .
Human Genome Projectin ja muiden genomin sekvensointiprojektien tutkimus on osoittanut, että ihmisen genomi on vain 30 % suurempi kuin Caenorhabditis elegans -sukkulamadon ja vain kaksi kertaa hedelmäkärpäsen Drosophila melanogaster . Nämä tiedot viittaavat siihen, että ihmisten ja selkärankaisten monimutkaisuus yleensä voi johtua vaihtoehtoisten silmukoiden lisääntyneestä käytöstä selkärangattomiin verrattuna [47] [48] . Ihmisen, hiiren, rotan , naudan , D. melanogasterin , C. elegansin ja Arabidopsis thalianan genomisten sekvenssien lisätutkimukset osoittivat kuitenkin, että vaihtoehtoisen silmukoinnin käytössä ei ole merkittävää eroa ihmisten ja muiden eukaryoottien välillä [49] . On kuitenkin näyttöä siitä, että saadut tiedot ovat artefakti , joka liittyy epätasaiseen sisällyttämiseen eri organismeista otettujen komplementaaristen DNA-sekvenssien vertailuanalyysiin. Kun verrattiin vaihtoehtoisen silmukoinnin käyttötiheyttä verratuista organismeista saaduissa satunnaisissa geeninäytteissä, kävi ilmi, että vaihtoehtoinen silmukointi on edelleen yleisempää selkärankaisilla kuin selkärangattomilla [50] .
Muutokset RNA:n prosessointilaitteistossa voivat johtaa silmukointihäiriöihin monissa transkripteissa, ja yksittäisten nukleotidien substituutiot silmukointikohdissa tai cis - säätelysilmukointikohdissa johtavat eroihin saman geenin silmukoitumisessa, kuten mutatoidun geenitranskriptin silmukoitumisessa. Vuonna 2005 tehdyssä tutkimuksessa osoitettiin, että yli 60 % mutaatioista, jotka johtavat sairauksien kehittymiseen, eivät vaikuta itse koodaavaan sekvenssiin, vaan silmukoitumiseen [51] . On myös osoitettu, että noin kolmasosa perinnöllisistä sairauksista liittyy silmukointihäiriöihin [25] .
Epänormaalisti silmukoituneita mRNA:ita löytyy merkittävästä osasta syöpäsoluja [7] [8] [10] . RNA-Seq:n ja proteomien analyysi osoitti selkeitä eroja niiden proteiinien silmukointiisoformien ilmentymisessä, jotka osallistuvat syövän kehittymiseen liittyviin signalointireitteihin [52] . Ei tiedetä, vaikuttavatko silmukointihäiriöt suoraan syövän kehittymiseen vai ovatko ne seurausta soluprosessien hajoamisesta, joka johtuu siirtymisestä syöpäkasvuun. On havaittu, että joissakin syöpätyypeissä, kuten paksusuolensyövässä tai eturauhassyövässä , silmukointivirheiden määrä eri potilailla vaihteli merkittävästi; tätä ilmiötä on kutsuttu transkriptomiseksi epästabiiliudeksi [53] [54] .
Lisäksi transkription epävakauden on osoitettu liittyvän silmukointitekijägeenien vähentyneeseen ilmentymiseen. Itse asiassa yleensä vaihtoehtoista silmukointia käytetään vähemmän syöpäsoluissa kuin normaaleissa soluissa, ja myös silmukointimallit vaihtelevat. Siten syöpäsoluissa introniretentiota esiintyy useammin kuin normaaleissa soluissa, kun taas eksonien ohittamista tapahtuu harvemmin. Silmukoitumisen ominaisuudet syöpäsoluissa voivat liittyä somaattisten mutaatioiden korkeaan esiintymistiheyteen silmukointitekijöiden geeneissä, ja jotkin piirteet voivat johtua transsäätelytekijöiden fosforylaation muutoksista [ 55 ] [ 9] . Jotkut silmukoinnin ominaisuudet voivat liittyä muutokseen sen tekijöiden suhteellisessa lukumäärässä; esimerkiksi rintasyöpäsoluissa havaitaan kohonneita silmukointitekijän SF2/ASF [56] tasoja . Yksi tutkimus osoitti, että suhteellisen pieni osa (383/26 000) vaihtoehtoisista silmukointivarianteista oli huomattavasti yleisempää syöpäsoluissa kuin normaaleissa soluissa; tästä seuraa, että on olemassa rajoitettu määrä geenejä, joiden poikkeava silmukointi johtaa kasvaimen kehittymiseen [57] . Uskotaan kuitenkin, että heikentyneen silmukoinnin haitallista vaikutusta hillitsee erityinen solujen transkription jälkeinen ohjausmekanismi, nonsense-mediated decay [58] .
Esimerkki geenistä, jonka spesifinen silmukointivariantti liittyy syövän kehittymiseen ihmisillä, on yksi DNMT- geeneistä . Kolme DNMT-geeniä koodaavat entsyymejä, jotka lisäävät metyyliryhmiä DNA:han, ja näiden geenien modifioinnilla on usein säätelyvaikutuksia. Useita epänormaalisti silmukoituneita DNMT3B -geenin mRNA:ita on löydetty kasvaimista ja syöpäsolulinjoista . Kahden näistä mRNA:ista ilmentyminen aiheutti muutoksia DNA :n metylaatiossa näissä soluissa. Solut, joissa oli yksi epänormaali mRNA, kasvoivat kaksi kertaa nopeammin kuin kontrollisolut, joten havaitut mRNA:t liittyvät syövän kehittymiseen [9] .
Toinen esimerkki on proto-onkogeeni Ron ( MST1R ). Syöpäsolujen tärkeä ominaisuus on niiden kyky siirtyä ( etäpesäkkeitä ) normaaleihin kudoksiin ja häiritä niiden toimintaa. Epänormaalisti silmukoituneen Ron-mRNA:n muodostuminen on yhdistetty kohonneisiin SF2/ASF-tasoihin rintasyöpäsoluissa. Tästä mRNA:sta transloitunut epänormaali Ron-isoformi lisäsi solujen liikkuvuutta [56] .
FOSB -proteiinin typistetyn version , ΔFosB, yli-ilmentyminen tietyssä hermosolupopulaatiossa nucleus accumbensissa on huumeriippuvuuden ja luonnollisen palkkion syntymisen ja säilymisen taustalla [ 59] [ 60] [61] [62] .
Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat kromatiinin rakenteen ja histonimuutosten roolin vaihtoehtoisen silmukoinnin säätelyssä. Siksi epigeneettiset tekijät voivat vaikuttaa geenien ilmentymisen lisäksi myös niiden silmukoitumiseen [63] .
Vaihtoehtoisen silmukoinnin genominlaajuinen analyysi on haastava tehtävä. Tyypillisesti vaihtoehtoisesti silmukoidut transkriptit löydetään vertaamalla ekspressoituja sekvenssimerkkejä ( englanniksi Expressed sequence tag, EST ). Useimmat EST-kirjastot kootaan hyvin rajallisesta määrästä kudoksia, joten kudosspesifisiä transkriptioita ei ole aiemmin otettu huomioon. Silmukoinnin tutkimiseen on kuitenkin ilmaantunut suuritehoisia menetelmiä, kuten DNA-mikrosiruja ja syväsekvensointia ( eng. deep sekvensointi ). Näillä menetelmillä voidaan etsiä polymorfismeja ja mutaatioita, jotka sijaitsevat niissä silmukointielementeissä, jotka vaikuttavat proteiinien sitoutumiseen, tai niiden välittömässä läheisyydessä. Yhdistämällä nämä menetelmät silmukointitekniikoihin, kuten in vitro reportterigeenianalyysiin , on mahdollista tutkia polymorfismien ja mutaatioiden vaikutusta pre-mRNA-silmukoitumiseen [ 25] [30] [64] .
Microarray-analyysi käyttää DNA-fragmentteja, jotka ovat yksittäisiä eksoneja (kuten Affymetrix microarray ) tai eksonien välisiä rajoja. Leimattu cDNA kiinnostuksen kohteena olevasta kudoksesta lisätään sitten mikrosiruun. Tämä koettimen cDNA sitoutuu komplementaarisesti jo mikrosirussa oleviin DNA-fragmentteihin. Tämän menetelmän ansiosta tiettyjen vaihtoehtoisesti silmukoituneiden mRNA:iden läsnäolo voidaan havaita [65] .
CLIP-menetelmä ( englanniksi Cross-linking and immunoprecipitation - crosslinking and immunoprecipitation ) käyttää UV-säteilyä silmukoitumisen läpikäyvien proteiinien ja RNA:n välisten siltojen muodostamiseen. Trans- vaikuttavat säätelevät silmukointiproteiinit saostetaan sitten spesifisillä vasta- aineilla . Kun proteiiniin liittyvä RNA eristetään ja kloonataan, säätelyproteiiniin liittyvän RNA:n sekvenssi määritetään [6] . Reportterigeenien käyttö mahdollistaa splaisoivien proteiinien tunnistamisen tietyissä vaihtoehtoisissa silmukointitapauksissa: riippuen siitä, miten silmukointi tapahtui, reportterigeeni synnyttää kaksi erilaista fluoresoivaa proteiinia . Tätä menetelmää käytettiin sellaisten mutanttien eristämiseen , joiden silmukointi oli heikentynyt, ja näissä mutanteissa inaktivoituneiden säätelevien silmukointiproteiinien tunnistamiseen [6] .
| Transkription jälkeiset muutokset | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ydin |
| ||||||||
| Sytosolinen |
| ||||||||