Proteomiikka on molekyylibiologian ala , joka on omistettu proteiinien tunnistamiseen ja kvantifiointiin (toisin sanoen korkean suorituskyvyn proteiinitutkimukseen). Termi "proteomiikka" ehdotettiin vuonna 1997 [1] . Solun kaikkien proteiinien kokonaisuutta kutsutaan proteomiksi [2] .
Proteomiikan tutkimuskohteena ovat proteiinit, jotka ilmentyvät tietyssä solussa , kudoksessa tai organismissa tietyllä hetkellä (eli proteomissa). Vaikka ensimmäiset proteomiikan menetelmät, kuten Edman-proteiinisekvensointi , ilmestyivät kauan ennen genomitekniikoita , proteiinien todella korkean suorituskyvyn tutkimus tuli mahdolliseksi vasta genomisen jälkeisellä aikakaudella, toisin sanoen eri organismien genomien tunnetuilla nukleotidisekvensseillä . .
Genomiikan ja transkriptomiikan jälkeen proteomiikka on seuraava askel biologisten järjestelmien tutkimuksessa. Proteomiikan päätehtävänä on uusien proteiinien tunnistaminen ja niiden kvantitatiivinen analyysi. Proteomiikka on siis objektiivisesti monimutkaisempaa kuin genomiikka, koska organismin genomi ei useimmissa tapauksissa muutu elämän aikana, vaan sen kaikkien proteiinien kokonaisuus muuttuu jatkuvasti. Jopa saman organismin erityyppisten solujen proteomit eroavat toisistaan. Lisäksi proteomin tutkimusta vaikeuttavat muut olosuhteet, esimerkiksi posttranslationaaliset modifikaatiot , joita monet proteiinit käyvät läpi (translation jälkeisiä modifikaatioita tutkitaan proteomiikan osioissa - fosfoproteomiikka ja glykoproteomiikka ). Monien proteiinien aktiivisuuden kannalta vuorovaikutukset muiden proteiinien ja RNA :n kanssa ovat kriittisiä , mikä myös vaikeuttaa niiden tunnistamista. Lopuksi, jotkut proteiinit ovat niin lyhytikäisiä ja hajoavat niin nopeasti, että niitä on erittäin vaikea korjata käytettävissä olevilla menetelmillä [3] .
Proteomiikkamenetelmällä saadun tiedon avulla voidaan syventää ymmärrystä eri sairauksien, kuten hermoston rappeumasairauksien , syistä sekä kehittää hoitomenetelmiä. Proteomiikkaa käytetään uusien rokotteiden luomiseen sopivien antigeenien etsimiseen . Eri syövissä epänormaalisti ilmentyvien proteiinien tunnistaminen on erittäin tärkeää biomarkkeriavusteiselle diagnoosille , ennusteelle ja syövän hoidolle [4] .
Perinteinen lähestymistapa proteiinien tutkimukseen sisältää niiden eristämisen kudoksista ja soluista , jota seuraa puhdistus, jonka seurauksena on mahdollista analysoida puhdistetun proteiinin rakennetta ja toimintoja. Proteomiikassa on erilainen lähestymistapa: solun koko proteiinipitoisuus voidaan nähdä ja analysoida yhdessä vaiheessa. Tämän on mahdollistanut menetelmien ja teknologioiden, kuten massaspektrometrian ja kaksiulotteisen elektroforeesin , tulo ja kehitys . Proteomiikan menetelmät eivät kuitenkaan rajoitu näihin kahteen esimerkkiin [2] . Alla on tällä hetkellä käytössä olevat menetelmät proteiinien tutkimiseen, mukaan lukien menetelmät kvantitatiiviseen analyysiin ja proteiinin aminohapposekvenssin sekvensointiin, joita käytetään harvoin tässä vaiheessa.
Entsymaattista aktiivisuutta omaavien proteiinien kvantitatiivinen analyysi voidaan suorittaa epäsuorasti määrittämällä näiden proteiinien aktiivisuus Jo 1900-luvun alussa tällainen analyysi voitiin tehdä spektrofotometrisin menetelmin . Katalyytin määrä arvioidaan tavanomaisissa aktiivisuusyksiköissä. Ehdollisia aktiivisuusyksiköitä käytetään edelleen kuvaamaan sellaisten biomarkkerien , kuten alaniiniaminotransferaasin ja aspartaattiaminotransferaasin , pitoisuutta veressä . Vuonna 1975 kehitettiin menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi , ja niille löydettiin nopeasti käyttöä proteiinitutkimuksessa. Esimerkiksi, jos tietyn vasta -aineen antigeeni tunnetaan , tätä vasta-ainetta voidaan käyttää tutkittavan antigeenin tunnistamiseen koenäytteestä. Lääketieteessä biomarkkereina käytetään 2000-luvulla laajalti vasta-aineita, joiden antigeenejä ei tunneta, mutta jotka sitovat sairailla ihmisillä paljon enemmän antigeeniä kuin terveillä ihmisillä. Esimerkiksi CA-125- glykoproteiinia on käytetty munasarjasyövän biomarkkerina vuodesta 1981, jolloin sille saatiin vasta-aineita. Paljon myöhemmin itse proteiini, musiini 16, tunnistettiin [5] .
Frederick Sanger määritti vuonna 1953 insuliinihormonin aminohapposekvenssin . N-terminaalisen tähteen leimaamiseen ja tunnistamiseen Sanger ehdotti 1-fluori-2,4-dinitrobentseenin käyttöä . Proteiinin N-terminaalisen jäännöksen sitomisen jälkeen tällä reagenssilla polypeptidiketju hydrolysoidaan kloorivetyhapolla aminohappojen erottamiseksi ja leimattu jäännös havaitaan. Jos proteiini koostuu useista polypeptidiketjuista, niin molemmat N-terminaaliset tähteet merkitään, eli yksittäisten polypeptidiketjujen lukumäärä proteiinissa selviää. Koko proteiinisekvenssin sekvensointiin käytetään yleisemmin Edmanin sekvensointimenetelmää [6] .
1950 -luvulla ruotsalainen kemisti Edmania kohti keksi menetelmän proteiinien aminohapposekvenssin määrittämiseksi (sekvensointi). Edman -sekvensoinnin ensimmäinen vaihe on fenyyli -isotiosyanaatin tutkittavan peptidin käsittely , joka on vuorovaikutuksessa aminoryhmän kanssa , mikä antaa fenyyliakarbomoyyliradikaalin . Liuoksen kohtalaisella happamoitumisella se pilkotaan pois ottaen N-terminaalisen aminohapon. Seurauksena on, että tiatsolinoni, jolla on radikaali spesifinen tälle aminohapolle, tulee liuokseen. Tätä johdannaista analysoidaan kromatografisesti määrittäen, mikä aminohappo oli N-päässä, ja sykli toistetaan. Jos tutkittavana oleva proteiini kiinnitetään kiinteään tukeen, niin jokaisen fenyyli-isotiosyanaatin käsittelyn jälkeen se voidaan pestä poistamalla N-terminaalinen tiatsolinoni ja uusi sykli voidaan aloittaa. Edman -menetelmä mahdollistaa jopa 30 aminohappotähteen sekvenssien määrittämisen korkealla tarkkuudella. Menetelmän korkea herkkyys mahdollistaa myös alle 0,1 nmol -sekvensoinnin peptidiä 99%: n tarkkuudella. Edman-menetelmällä sekvensoitavan polypeptidiketjun pituus riippuu yksittäisten vaiheiden tehokkuudesta, jonka puolestaan määrää polypeptidin aminohappokoostumus [7] .
1960-luvulla luotiin automaattinen sekvensseri, joka toteutti Edman-menetelmän. Insuliinin primäärirakenne, jonka määrittämiseen Sangerilta kesti yli 10 vuotta, voidaan nyt saada muutamassa päivässä suoralla sekvensoinnilla proteiinisekvensoijalla [7] . Edmanin menetelmää käytetään nykyään toisinaan sellaisten organismien tutkimuksessa, joiden genomisekvenssiä ei tunneta [8] [9] [10] . Perinteistä proteiinisekvensointia käytetään myös tapauksissa, joissa monia niiden ominaisuuksia (esimerkiksi translaation jälkeisiä modifikaatioita) ei voida tunnistaa vain geenisekvenssistä [11] .
Useimmat proteiinit on erityisesti valmisteltava sekvensointia varten ennen sekvensointia. Ensinnäkin proteiinin disulfidisidokset tuhotaan , jos niitä on, hapettamalla permuurahaishapolla tai pelkistämällä ditiotreitolilla . Seuraavaksi proteaasit fragmentoivat proteiiniketjun , koska pitkien proteiinien sekvensointi ei ole kovin tarkkaa. Tyypillisesti trypsiiniä käytetään hydrolyysiin , joka vaikuttaa vain niihin peptidisidoksiin, joiden karbonyyliryhmä kuuluu lysiini- tai arginiinitähteeseen . Siksi, jos lysiini- ja arginiinitähteiden lukumäärä proteiinissa määritetään täydellisen hydrolyysin aikana, on mahdollista ennustaa, kuinka monta fragmenttia proteiini hajoaa trypsiinikäsittelyn jälkeen. Saadut fragmentit puhdistetaan edelleen elektroforeesilla (katso alla ) tai kromatografialla ja sekvensoidaan Edmanin mukaan. Proteiinifragmentti fragmentilta sekvensoimiseksi se leikataan paloiksi entsyymillä, joka tunnistaa eri tähteitä kuin trypsiinin tunnistamat tähteet. Kahden tuloksena olevan fragmenttisarjan päällekkäisyyksien perusteella proteiinin täydellinen aminohapposekvenssi palautetaan [12] .
Disulfidisidosten sijainnin määrittämiseksi proteiini pilkotaan jälleen trypsiinillä, mutta disulfidisidoksia ensin tuhoamatta. Tuloksena saadut fragmentit erotetaan elektroforeesilla ja niitä verrataan fragmenttien joukkoon, joka on saatu ensimmäisellä trypsiinillä digestiolla. Jos kahden fragmentin välillä on disulfidisidos, erotettaessa ensimmäinen fragmenttisarja, ne näyttävät kahdelta nauhalta geelissä, ja toisen elektroforeesin aikana ne muodostavat yhden nauhan [13] .
1970- ja 1980-luvuilla proteiinien eristys- ja puhdistusmenetelmät kukoistivat. Näissä menetelmissä yhdistettiin kromatografian, elektroforeesin ja sentrifugoinnin periaatteet ; monet niistä ovat jo aikoja sitten poistuneet käytöstä, mutta jotkut ovat edelleen käytössä 2000-luvulla. Vuonna 1970 sveitsiläinen tiedemies Ulrich Laemmli ehdotti menetelmää proteiinien erottamiseksi elektroforeesilla denaturoivissa olosuhteissa. Ensin proteiinit altistettiin vakavalle denaturaatiolle natriumdodekyylisulfaatin ( englanniksi sodium dodecyl sulphate, SDS ) vaikutuksesta, joka peitti jokaisen proteiinimolekyylin kerroksen muodossa . Mitä suurempi proteiini on, sitä enemmän SDS on sitoutunut siihen ja sitä suuremman negatiivisen varauksen kompleksi sai. Siksi, kun näytteitä levitettiin polyakryyliamidigeelille , ne alkoivat liikkua sähkökentän vaikutuksesta ; samalla proteiinimolekyylien liikenopeus riippuu niiden massasta (kevyemmät proteiinit liikkuvat nopeammin geelin läpi). Menetelmä soveltuu hyvin 5-250 kDa :n massaisten proteiinien erottamiseen [14] .
Laemmlin menetelmää kehitettiin edelleen. Vuonna 1975 Patrick O'Farell ja Joachim Klose ehdottivat itsenäisesti niin sanotun kaksiulotteisen elektroforeesin periaatetta : ennen massaerotusta SDS:llä proteiinit esierotetaan niiden isoelektrisen pisteen mukaan . Proteiinit syötetään ensin lasiputkeen, joka on täytetty erityisillä polymeereillä , jotka luovat siihen kiinteän pH -gradientin . Proteiinit jakautuvat putkea pitkin ja ovat paikoissa, joiden pH on yhtä suuri kuin niiden isoelektrinen piste. Seuraavaksi putken sisältö puristetaan ulos ja sulatetaan geeliin tavanomaista Laemmli-elektroforeesia varten. Siten proteiinit jaetaan ensin isoelektrisellä pisteellä ja sitten massalla. Kaksiulotteisen elektroforeesin tuloksena jokainen proteiini ei vastaa vyöhykettä, kuten tavanomaisessa elektroforeesissa, vaan fokusoitua pyöreää täplää, jonka koko ja värin intensiteetti vastaavat proteiinipitoisuutta. Kaksiulotteisen elektroforeesin avulla on mahdollista erottaa paitsi eri proteiineja, myös saman proteiinin isoformeja sekä proteiinimuotoja erilaisilla translaation jälkeisillä modifikaatioilla . Kaksiulotteiseen elektroforeesitekniikkaan on ehdotettu erilaisia parannuksia, joista osa sen vaiheista, samoin kuin skannattujen geelien käsittely, on automatisoitu. Itse asiassa kaksiulotteinen elektroforeesi on ainoa tapa visualisoida proteomi [15] [16] [17] .
Joissakin tapauksissa on tarpeen määrittää, minkä soluproteiinien kanssa eristetyt vasta -aineet ovat vuorovaikutuksessa . Usein ongelmana on käänteinen: on mahdollista määrittää eristetty proteiini käyttämällä siihen spesifisesti sitoutuvia vasta-aineita. Tätä varten on olemassa Western blot -menetelmä tai immunoblottaus. Kun sitä käytetään, proteiinit tutkittavasta lysaatista erotetaan ensin geelielektroforeesilla ja siirretään geelistä huokoiselle kalvolle. Seuraavaksi kalvo käsitellään peräkkäin kohdeproteiinille spesifisillä vasta-aineilla ja radioaktiivisesti leimatuilla vasta-aineilla, jotka sitoutuvat ensimmäisiin vasta-aineisiin. Joskus toisten vasta-aineiden sijasta suoritetaan entsymaattinen reaktio ensimmäisten vasta-aineiden kanssa. Tämän seurauksena kohdeproteiinin molekyylit, jotka vasta-aineet tunnistavat, havaitaan vyöhykkeinä autoradiogrammissa tai täplinä kalvolla, joiden avulla proteiini voidaan tunnistaa [18] [19] .
Massaspektrometria sisältää joukon menetelmiä, joiden tarkoituksena on määrittää tutkittavien yhdisteiden molekyylipaino . Se on löytänyt laajan levityksen biologiassa , etenkin proteomiikassa. Massaspektrometriaa käytettäessä näytteen proteiinit on ensin ionisoitu , sitten tyhjiöolosuhteissa ionit lajitellaan ja havaitaan, jolloin saadaan spektri, jota analysoidaan edelleen erityisillä laskennallisilla menetelmillä. Viime kädessä jokaiselle ionille määritetään massa -suhteen arvon arvo. Jos ionin varaus on yhtä suuri kuin yksi, suhde on numeerisesti yhtä suuri kuin sen molekyylipaino. Aluksi massaspektrometrian käyttö biologiassa oli rajoitettu, koska ionisaatio oli erittäin ankara ja johti molekyylien tuhoamiseen. 1980-luvulla kehitettiin menetelmä molekyylien ionisoimiseksi laserilla niiden yhteiskiteytyessä valoherkän orgaanisen aineen kanssa (niin kutsutaan matriisiksi). Matriisi ympäröi tutkitun aineen molekyylejä ja ionisoivat laserilla naapurimolekyylejä. Tietyissä olosuhteissa ionisaatio voidaan suorittaa tuhoamatta tutkittavia molekyylejä. Tätä menetelmää kutsutaan matriisiavusteiseksi laser desorptioionisaatioksi ( MALDI ) . Uusi ionisaatiomenetelmä yhdistettiin tavanomaiseen massaspektrometriseen ilmaisimeen ( lentoaika , TOF ) . Tässä ilmaisimessa ionit liikkuvat tyhjiöputkessa ja saavuttavat herkän levyn (fotomultiplier -putki), joka on ilmaisin. Aika, joka vie ionin putken pituuden kuluttamiseen, on käänteisesti verrannollinen sen massaan. 1990-luvulla ja 2000-luvun alkupuolella MALDI-TOF-menetelmää käytettiin hyvin aktiivisesti proteiinitutkimuksiin [20] [21] .
Isotooppisen erotuksen erityispiirteiden vuoksi suurten proteiinien spektrien huippuja on erittäin vaikea analysoida. Tästä syystä ne hajotetaan trypsiinientsyymillä 500-2500 Da peptideiksi ennen analysointia ja sitten peptidien tiedoista palautetaan tiedot alkuperäisestä proteiinista, aivan kuten sekvensoitaessa uuden sukupolven nukleiinihappoja , alkuperäiset sekvenssit ovat kerätty lyhyistä lukemista . Tätä lähestymistapaa kutsutaan " alhaalta ylös -proteomiikaksi " ( eng. bottom-up ). Kokoonpanoprosessi ei ole virheetön ja johtaa suuriin informaatiohäviöihin, joten joissain tapauksissa kokonaisia proteiineja tutkitaan ilman pilkkomista tehokkailla ultrakorkean resoluution ilmaisimilla (" top-down proteomics ", englanniksi top-down ) [22] .
Peptidien molekyylipainot, jotka saatiin käsittelemällä proteiinia trypsiinillä, on ainutlaatuinen jokaiselle proteiinille. Tämä johtuu pääasiassa trypsiinin korkeasta spesifisyydestä, joka leikkaa vain lysiini- ja arginiinitähteet . Vertaamalla saatua kuvaa tutkitun proteiinin peptidien molekyylimassoista tietokannoista saatuihin proteiinien peptidikarttoihin on mahdollista määrittää, mitä proteiinia tutkittiin. Tätä lähestymistapaa kutsutaan peptidisormenjäljeksi [23] . Koska on mahdotonta saavuttaa täydellistä vastaavuutta peptidien kokeellisen massajakauman ja vertailupeptidikarttojen välillä, otettiin käyttöön kvantitatiivinen arvio ( englanninkielinen pistemäärä ) todennäköisyydestä, että kokeellinen peptidikartta vastaa tätä teoreettista karttaa. Peptidisten sormenjälkien ottamiseen on kehitetty erityisiä ohjelmia, esimerkiksi MOWSE [24] .
Sen sijaan, että proteiinit fragmentoidaan trypsiinillä ennen näytteiden sijoittamista massaspektrometriin , proteiinien fragmentointi fragmenteiksi voidaan tehdä itse massaspektrometrissä, esimerkiksi törmäämällä inerttien kaasumolekyylien kanssa . Jokaiselle peptidille on tunnusomaista prekursori-ionin massa ja fragmentti-ionien massojen joukko. Fragmenttien massat voidaan mitata ja niistä voidaan palauttaa tietoa alkuperäisestä proteiinista, koska fragmenttien molekyylipainot voidaan löytää peptidisekvenssin perusteella. Tätä lähestymistapaa kutsutaan tandem-massaspektrometriaksi (MS-MS). Kuten peptidien sormenjälkien ottamisessa, myös tandemmassaspektrometriassa on todennäköisyysarviointi, että tutkittavan proteiinin peptidikartta vastaa jotakin teoreettisista. Vuonna 2007 ehdotettiin kohde-syöttimenetelmää tandemmassaspektrometriatietojen analysointiin . Tämän lähestymistavan ydin piilee siinä, että data-analyysin aikana kohdeteoreettisiin peptideihin alettiin lisätä yhtä paljon merkityksettömiä, vääriä ( englanniksi decoy - a false goal) peptidejä . Tämän lähestymistavan avulla voit arvioida analyysin laatua. Jos analyysi parhaimpana osumana osoittaa kokeellisen proteiinin vastaavuuden ilmeisen väärennetyn proteiinin kanssa, niin se antaa väärän positiivisen tuloksen , ja kohde-syöttimenetelmä mahdollistaa väärien positiivisten tulosten osuuden arvioimisen [25] .
Vaihtoehtona MALDI:lle peptidien ionisointi ennen massaspektrometriaa voidaan suorittaa käyttämällä sähkösumutusionisaatiomenetelmää ( ESI ) . Tutkittavia proteiineja sisältävä neste asetetaan kartiomaiseen kapillaariin, ja sen poistuttua kapillaarista siihen kohdistetaan voimakas jännite . Tämän seurauksena neste muuttuu aerosoliksi, ja kun aerosolihiukkaset haihtuvat inertissä kaasuvirrassa, varaus voi siirtyä aerosoliin liuenneisiin biomolekyyleihin , mukaan lukien proteiineihin. Tällä ionisaatiomenetelmällä biomolekyylejä ei tuhota. Sähkösumutusionisaatio voidaan helposti yhdistää korkean suorituskyvyn nestekromatografiaan : kromatografisen faasin virtaus kolonnista voidaan ohjata suoraan sähkösumutuskapillaariin. Siten massaspektrometri määrittää analyyttisessä kolonnissa erotettujen molekyylien massat. Tämä menetelmä on lyhennetty LC-MS:ksi (englannin kielestä nestekromatografia - massaspektrometria ) [26] . Proteiinien tunnistamista kompleksisessa liuoksessa massaspektrometrian ja korkean suorituskyvyn nestekromatografian yhdistelmällä kutsutaan haulikkoproteomiikaksi [ 27 ] .
Massaspektrometriatekniikoita voidaan käyttää kiinnostavien proteiinien kohdistamiseen, ts. Massaspektrometri voidaan virittää vain halutun peptidin näkemiseksi. Tätä tarkoitusta varten käytetään laitetta, jossa on kolminkertainen kvadrupoli -tyypin ilmaisin , ts. Kolme identtistä massaspektrometriä, jotka siirtävät ionit peräkkäin toisiinsa. Ensimmäinen massaspektrometri suodattaa kiinnostavan peptidin, toisessa se on fragmentoitu ja kolmas rekisteröinti 3 - 5 ennalta valitun fragmentin. Kvantitatiivinen analyysi suoritetaan fragmenttien voimakkuuden perusteella. Tätä menetelmää kutsutaan monen reaktion seurannaksi (MRM ) tai valitun reaktion seurannan ( valittu reaktion seuranta , SRM ) [28] .
Yksi suosituimmista menetelmistä proteiini-proteiini-vuorovaikutusten tutkimiseksi on hiivan kahden hybridijärjestelmän käyttö . Tätä tarkoitusta varten saadaan kaksi haploidihiivan kantaa , joista toinen on tutkittava proteiini (syötti), ja toinen on proteiini, joka on testattava vuorovaikutuksen suhteen ensimmäisen (saaliin) kanssa. Haploidisolut fuusioituu sitten diploidisten hiivasolujen muodostamiseksi, jotka ekspressoivat molempia proteiineja. Jos proteiinit ovat vuorovaikutuksessa, ne molemmat muodostavat transkriptiotekijän, joka laukaisee reportterigeenin ekspression . Jos proteiinien välillä ei ole vuorovaikutusta, reportterigeenin ilmentyminen ei käynnisty. Tätä lähestymistapaa käyttämällä hiiva S. cerevisiaessa , seulonta 6000 saalista kloonia 6000 syöttikloonia vastaan, oli mahdollista tunnistaa 691 proteiini-proteiini-vuorovaikutusta, joista vain 88 oli aiemmin tunnettu [29] . 2000-luvulla muita menetelmiä, kuten plasmoniresonanssi [30] [31] , käytetään proteiini-proteiini-vuorovaikutusten tutkimiseen .
Proteiini-proteiini-vuorovaikutustietojen perusteella on joissain tapauksissa mahdollista arvioida proteiinin toimintoja. Jos esimerkiksi proteiinin tiedetään olevan vuorovaikutuksessa useiden proteiinien kanssa samassa aineenvaihduntareitissä , on todennäköistä, että myös se osallistuu siihen. Proteiinien vuorovaikutusten karttoja kutsutaan vuorovaikutuksiksi . On olemassa tietokantoja , jotka tallentavat tietoa proteiinien vuorovaikutuksista [32] .
Proteiini-proteiini-vuorovaikutuksista tiedot ovat erittäin tärkeitä biologisille verkostoille ja systeemibiologialle : niitä käytetään esimerkiksi signalointikaskadien rekonstruoinnissa [33] [34] .
Proteiinimikrosiruja kehitetään spesifisten proteiinien tunnistamiseksi näytteestä. Analogisesti DNA-mikrosirujen kanssa , hyvin pieniä pisaroita, jotka sisältävät vasta-aineita, levitetään kiinteälle substraatille. Jokainen tippa sisältää leimattuja vasta-aineita yhdelle spesifiselle proteiinille, joka lisätään sirulle fluoresoivasti leimatuna -näytteenä. Pesun jälkeen fluoresenssi havaitaan vain niissä pisaroissa, joissa vasta-aineet ovat sitoneet tutkittavaa proteiinia. Vasta-aineiden sijasta voidaan käyttää muita molekyylejä, jotka ovat spesifisesti vuorovaikutuksessa spesifisten proteiinien kanssa, esimerkiksi oligonukleotideja [35] . Proteiinimikrosiruja voidaan käyttää myös proteiini-proteiinivuorovaikutusten havaitsemiseen ja proteiinien toimintojen määrittämiseen. 2000-luvulla proteiinien mikrosirut automatisoitiin. Ne ovat erittäin herkkiä ja vaativat hyvin vähän proteiinia testattavaksi, mikä tekee niistä taloudellisia [36] .
Massaspektrometrialla ja siruilla saa tietoa proteiinifragmenteista, mutta ei koko proteiinista. Tältä osin on luotu ohjelmia, jotka massaspektrometrian ja sirujen fragmentaarisista tiedoista tarjoavat tietoja proteiineista, jotka on koottu melkein kokonaan näistä fragmenteista. Nämä ohjelmat perustuvat UniProt [37] - ja PROSITE [38] -tietokannoista peräisin olevien tunnettujen proteiinien fragmenttien kohdistamiseen .
Useimmat proteiineja analysoivat ohjelmat eivät ota huomioon niiden translaation jälkeisiä modifikaatioita [39] . Olemassa olevat työkalut, jotka määrittävät translaation jälkeiset muutokset, ovat vain ennustavia [40] .
Bioinformatiikan laskennallisia menetelmiä käytetään aktiivisesti biomarkkeriproteiinien tutkimuksessa . Siten tietokonemallien avulla pystyttiin osoittamaan intensiivinen proteiinien vaihto äidin kehon ja sikiön välillä raskauden aikana , ja analyysi vaati vain ei-invasiivisen verinäytteen ottamista äidiltä [41] .
Proteogenomiikka , joka käyttää proteomiikan menetelmiä genomisista sekvensseistä saadun tiedon vahvistamiseen , on kehittymässä [42] [43] . On myös rakenteellista proteomiikkaa, joka käsittelee laajamittaista proteiinirakenteiden tutkimusta, joka perustuu röntgendiffraktioanalyysiin ja NMR-spektroskopiatietoihin [44] .
Viimeaikaiset kvantitatiivisen proteomiikan edistykset sallivat sen käytön solujärjestelmien perusteelliseen analyysiin [33] [34] . Biologisten järjestelmien käyttäytymisen kuvaus vasteena erilaisille vaikutuksille (ulkoisten tekijöiden vaikutus, solufysiologian muutokset solusyklin eri vaiheista jne .) Proteiinikoostumuksen muutosten tasolla mahdollistaa syvemmän ymmärtämisen monien biologisten prosessien ydin. Tämän vuoksi proteomiikka yhdessä genomiikan, transkriptiikan, epigenomian , metabolomian ja muun ”-omikan” kanssa sisältyvät uuteen tieteelliseen suuntaan - järjestelmien biologiaan . Siten The Cancer Proteome Atlas sisältää kvantitatiivisia tietoja noin 200 proteiinin ilmentymisestä yli 4000 analysoidussa kasvainnäytteessä täydentäen The Cancer Genome Atlas -kirjaa , joka sisältää genomi- ja transkriptitietoja näistä proteiineista [45] .
MALDI-TOF:n avulla patogeenit voidaan tunnistaa sukuihin ja lajeihin saakka . Ehjät bakteerisolut levitetään massaspektrometrin metallikohteeseen, peitetään matriisilla, säteilytetään laserilla ja saadaan spesifisiä profiileja, jotka koulutettu algoritmi tunnistaa ominaismassoilla [46] .
Mahdollisuutta käyttää proteomiikan avulla syövän diagnosointia analysoimalla proteiinien biomarkkereita sekä määrittämään kasvaimen pahanlaatuisuusastetta tutkitaan . Tähän suuntaan on jo edistytty. Esimerkiksi Yhdysvalloissa on sallittua käyttää vuonna 2015 kehitettyä Xpresys Lung -testiä, joka käyttää useiden veriplasman proteiinien kohdennettua massaspektrometriaa ja arvioi keuhkoissa olevien kasvainkyhmyjen pahanlaatuisuuden astetta [47] .
Proteomiikan viimeisimmät saavutukset - massaspektrometrian, organelliproteiinien ja kalvoproteiinien erottamisen alalla - voivat mahdollistaa sydämen proteomin tutkimisen ja muunnettujen proteiinien tunnistamisen (sekä niiden modifikaation luonteen määrittämisen). Tiedot sydämen proteomista auttavat ymmärtämään erilaisten sydän- ja verisuonisairauksien mekanismeja [48] .
Monet lääkkeet ovat joko proteiineja itse tai vaikuttavat tiettyihin proteiineihin. Siksi lääkkeiden kehittämiseen osallistuvat asiantuntijat omaksuivat proteomiikan . Useimmilla lääkeyhtiöillä on proteomiikkaan erikoistunut proteomiikkaosasto tai kumppaniyritys. Proteomiikan menetelmillä varmistetaan kehitettyjen lääkkeiden kohteiden validiteetti, määritetään biomarkkerien tehokkuus, tutkitaan lääkkeen vaikutusmekanismia ja sen toksisuutta . Proteomiikkamenetelmiä käytetään erityisesti sellaisten malarialääkkeiden etsimiseen, jotka sitoutuvat puriinia sitoviin proteiineihin punasolujen plasmodiumin lisääntymisvaiheessa ja niiden vapautuessa vereen 48] .
Kahden organismin (ei välttämättä läheistä sukua) proteomien vertailu mahdollistaa sekä näille kahdelle organismille yhteiset proteiinit että proteiinit, jotka aiheuttavat eroja niiden fenotyypeissä . Tällainen analyysi voi tarjota hyödyllistä tietoa evoluutioprosessin ymmärtämiseksi [49] , ja joskus sen avulla voimme määrittää proteiinien aiemmin tuntemattomia toimintoja. Vertailevaa proteomiikkaa käyttämällä on esimerkiksi tunnistettu lisääntymiseen liittyviin prosesseihin osallistuvan hyönteisen Nilaparvata lugens proteiineja , joiden ilmentyminen muuttuu vasteena hyönteismyrkkykäsittelylle [50] .
Proteomiikan historia juontaa juurensa vuoteen 1950, jolloin Edman ehdotti menetelmää proteiinien sekvensointiin. Vuonna 1958 Frederick Sangerin tutkimusryhmä määritti insuliinin aminohapposekvenssin . Vuonna 1959 syntyi immunomääritysmenetelmä , jolla on suuri merkitys proteiinien tutkimukselle. Vuonna 1967 luotiin ensimmäinen automaattinen sekvensseri, joka määrittää proteiinien aminohapposekvenssit Edmanin menetelmällä. Vuonna 1970 Laemmli ehdotti menetelmää proteiinien erottamiseksi käyttämällä denaturoivaa polyakryyliamidigeelielektroforeesia, ja vuonna 1975 ehdotettiin sen pohjalta kaksiulotteista elektroforeesitekniikkaa. Vuonna 1984 keksittiin sähkösumutusionisaatiomenetelmä, joka mahdollisti proteiinien tutkimisen massaspektrometrialla niitä tuhoamatta, ja vuonna 1985 ehdotettiin MALDI-ionisaatiomenetelmää. Vuonna 1994 ilmestyivät ensimmäiset peptidikartat massaspektrometriaa varten. Vuonna 1996 jatko-opiskelija Mark Wilkins loi termin "proteomi", ja seuraavana vuonna termi "proteomiikka" ilmestyi. Vuonna 1999 ilmestyivät ensimmäiset ohjelmat ennustaakseen fragmentteja, joiden massat määritettäisiin massaspektrometrialla proteiinisekvenssistä. Vuonna 2001 syntyi haulikkoproteomiikka , ja vuoteen 2014 mennessä tällä menetelmällä oli mahdollista tunnistaa 20 000 ihmisen proteiinia yhdestä näytteestä [51] . Tällä hetkellä ei kehitetä ja parannetaan vain proteomiikan menetelmiä, kuten erilaisia massaspektrometrioita, vaan myös uusia ohjelmia proteomisen datan tulkintaan [52] .