Antisense-RNA:t

Antisense-RNA:t ovat yksijuosteisia RNA : ita , jotka ovat komplementaarisia solussa transkriptoidulle mRNA : lle tai kohdegeenille .  Antisense-RNA:iden toimintamekanismit ovat hyvin erilaisia, ne voivat sekä tukahduttaa että aktivoida kohdegeenin ilmentymisen . Luonnollisia antisense-RNA:ita löytyy sekä prokaryooteista että eukaryooteista [1] ; ne viittaavat pitkiin ei-koodaaviin RNA:ihin yli 200 nukleotidin pituisina RNA:ina [2] . Synteettiset antisense - RNA : t ovat löytäneet laajan käytön tutkijoiden keskuudessa työkaluna geenien tuhoamiseen . Antisense-RNA:t löytävät myös lääketieteellisiä sovelluksia [3] [1] [2] .

Opiskeluhistoria

Ensimmäiset antisense - RNA : t löydettiin tutkittaessa toiminnallisia proteiineja . Esimerkiksi tutkittaessa Escherichia colin ulkokalvon - poriinia osoitettiin, että jotkin tämän geenin promoottorit voivat tukahduttaa muiden kalvoporiinien , kuten ompF:n, ilmentymisen. Kävi ilmi, että 300 nukleotidin pituinen alue, joka sijaitsee ylävirtaan ompC-promoottorista, on itse asiassa osallisena suppressiossa. Se on 70-prosenttisesti homologinen ompF- mRNA :n 5'-terminaalisen osan sekvenssin kanssa , ja siitä luettu transkripti (micF) voi sitoutua siihen komplementaarisen vuorovaikutuksen ansiosta. Kävi ilmi, että stressiolosuhteissa ilmentyy micF, joka muodostaa dupleksin ompF-mRNA:n kanssa aiheuttaen sen hajoamisen [4] .

Toisin kuin sattumalta löydetty micF , useimmat antisense-RNA:t löydettiin kohdennetun genominlaajuisen pienten säätely-RNA:iden etsimisen ja transkriptioanalyysin aikana . Useimmat analyysialgoritmit ottavat kuitenkin huomioon vain geenien väliset alueet, ja antisense-RNA:t, jotka luetaan DNA-juosteesta vastapäätä templaattia (koodausjuostetta) koodaavan alueen alueella, jäävät huomiotta. Oligonukleotidiryhmiä voidaan käyttää tällaisten antisense- RNA:iden havaitsemiseen . Väärien positiivisten tulosten määrän minimoimiseksi on äskettäin aktiivisesti kehitetty menetelmiä transkription tutkimiseksi, joka on spesifinen jollekin ei-koodaavan RNA :n ketjusta, joka on vuorovaikutuksessa yksittäisten solujen kromatiinin ja RNA:n kanssa [1] .

Ajatus antisense-RNA:n käytöstä lääketieteessä esitettiin ensimmäisen kerran vuonna 1978, jolloin Zamecnik ja Stephenson saivat Rousin sarkoomaviruksen RNA:ta täydentäviä antisense-oligonukleotideja . Kävi ilmi, että ne tukahduttivat viruksen replikaatiota ja virusproteiinien synteesiä. Siitä lähtien antisense-RNA:n lääketieteellisten sovellusten kehittämiseen on omistettu valtavia ponnisteluja. Ensimmäinen laatuaan lääke, fomivirsen, hyväksyttiin FDA :ssa vuonna 1998. Se oli tarkoitettu sytomegaloviruksen aiheuttaman retiniitin hoitoon AIDS -potilailla . Vuonna 2004 lääke kuitenkin lopetettiin markkinoiden menettämisen vuoksi [5] .

Jakauma ja toiminnot

Ensimmäiset antisense-RNA:t löydettiin bakteerisoluista . Niitä koodasivat plasmidit , bakteerien genomit ja bakteriofagit . Esimerkiksi antisense-RNA, joka tunnetaan nimellä RNA I, luetaan ColE1-plasmidista ja sillä on tärkeä rooli plasmidien kopiomäärän määrittämisessä ja niiden replikaatiossa. Lisäksi tarvitaan toinen antisense-RNA (RNA II) ColE1-plasmidin replikaatioon. Se hybridisoituu DNA:n kanssa ja toimii replikaation alukkeena , minkä jälkeen RNaasi H hajottaa sen . Jos RNA II ei pysty hybridisoitumaan ColE1-DNA:n kanssa, tämän plasmidin kopioiden lukumäärä vähenee. Bakteriofaagissa P22 antisense - sar-RNA säätelee siirtymistä lysogeenisesta syklistä lyyttiseen sykliin säätelemällä Ant-proteiinin ilmentymistä [6] . Antisense-RNA:ita on löydetty myös kasveista . Tutkituin kasvin antisense-RNA luetaan FLC -geenistä . Arabidopsis thalianassa tämä geeni vastaa transkriptiotekijää, joka estää useiden kukintaa stimuloivien geenien ilmentymisen . Kylmissä olosuhteissa tämän geenin antisense-RNA, joka tunnetaan nimellä COOLAIR, ilmentyy. Se tukahduttaa FLC:n ilmentymisen modifioimalla kromatiinia, joka saa aikaan kukinnan [7] . Tyypillinen esimerkki antisense-RNA:iden vaikutuksesta nisäkässoluissa on X-kromosomin inaktivointi . Antisense RNA Xist houkuttelee polycomb 2 -repressiivisen kompleksin ( PRC2 ) yhteen X-kromosomeista , mikä aiheuttaa sen heterokromatinoitumisen [8] .

Luokitus

Antisense-RNA:t voidaan luokitella eri tavoin. Jotkut kirjoittajat jakavat ne antisense-RNA:iksi, jotka ovat vuorovaikutuksessa RNA:n, DNA:n ja proteiinien kanssa [8] . Ne voidaan myös luokitella sen promoottorityypin mukaan, josta niiden ilmentyminen alkaa: itsenäiset promoottorit, kaksisuuntaiset promoottorit tai kryptiset promoottorit. Pituus voi myös olla antisense-RNA:iden luokittelutekijä. Vaikka useimmat antisense-RNA:t ovat yli 200 nukleotidin pituisia ja ovat siksi pitkiä ei-koodaavia RNA:ita, jotkut ovat huomattavasti lyhyempiä. Koska suurin osa antisense-RNA:iden toimintamekanismeista on lajispesifisiä , ne voidaan myös luokitella lajin mukaan . Yleisin antisense-RNA:iden luokittelu perustuu kuitenkin siihen, kuinka näiden RNA:iden transkriptio korreloi niiden kohdegeenien kanssa [1] .

Cis - säätelevät antisense-RNA:t transkriptoidaan samassa lokuksessa kuin kohde-mRNA, mutta vastakkaisesta DNA-juosteesta. Tästä syystä ne ovat usein lähes täysin komplementaarisia kohdegeenin kanssa. Jos cis - säätelevien antisense-RNA:iden toiminta liittyy mRNA:han, niin yksi antisense-RNA voi olla kohteena vain yhteen mRNA:han. Tällaisten antisense-RNA:iden vaikutus mRNA:han ilmentyy estämällä ribosomin pääsy mRNA:han tai houkuttelemalla RNAaasia , joka tuhoaa mRNA:ta [4] . Cis -säätelyn antisense-RNA:iden joukossa on myösepigeneettisiä äänenvaimentimia ja aktivaattoreita. Ne voivat aiheuttaa epigeneettisiä muutoksia paikassa, josta ne transkriptoitiin. Ne voivat houkutella kromatiinia modifioivia proteiineja kohdelokukseen, mikä voi vaikuttaa paitsi kohdegeenin myös naapurigeenien ekspressioon [8] .

Transsäätelyn antisense-RNA:t transkriptoidaan kohdegeeneistä kaukana olevista lokuksista. Toisin kuin cis - säätely-RNA:t, ne ovat heikosti komplementaarisia kohdegeenille, mutta voivat olla pidempiä kuin cis - säätely-RNA:t. Ne voivat myös kohdistaa useita lokuksia. Epätäydellisestä komplementaarisuudesta johtuen transsäätelyn antisense-RNA:iden kompleksit kohdetranskriptien kanssa eivät ole kovin stabiileja, ja RNA - kaperoneja tarvitaan usein tällaisten RNA:iden toimintaan . Vaikutuksensa monimutkaisuuden vuoksi transsäätely - RNA:ita ei lähes koskaan pidetä mahdollisina lääkekohteena [4] .

Mekanismit

Monet antisense-RNA:t tukahduttavat kohdegeenien transkriptiota epigeneettisten mekanismien kautta. Ne voivat esimerkiksi aiheuttaa DNA:n metylaatiota , joka liittyy usein sairauteen. Siten alfa-talassemiassa LUC71-geenin epänormaali transkripti estää hemoglobiini a1 -geenin ( HBA1 Se toimii antisense-RNA:na ja indusoi HBA1-promoottorin metylaatiota . Akuutissa lymfoblastisessa leukemiassa ja akuutissa myelooisessa leukemiassa kasvainsuppressorigeeni p15INK4b vaimenee . Sen aiheuttaa antisense-RNA ANRIL , joka luetaan samasta lokuksesta kuin p15INK4b [8] . Antisense-RNA:t voivat myös aiheuttaa histonien metylaatiota , mikä voi johtaa sekä geenien repressioon että aktivoitumiseen [9] . Esimerkiksi ANRIL ei ainoastaan ​​laukaise DNA:n metylaatiota, vaan myös tukahduttaa viereisiä CDKN2B - ja CDKN2A -geenejä ja värvää niihin PRC2:ta, mikä tuo mukanaan repressiivisen epigeneettisen merkin (H3K27me). Toinen esimerkki on nisäkkäiden X-kromosomin inaktivointi antisense-RNA Xistillä [1] . Antisense-RNA:iden aiheuttamat muutokset kromatiinissa voivat myös olla transsäätelyä . Esimerkiksi nisäkkäissä HOTAIR antisense -RNA luetaan homeobox C (HOXC) -geenistä, mutta se värvää PRC2:n HOXD:hen. HOTAIR ilmentyy aktiivisesti primaarisissa rintasyöpäsoluissa [1] .

Antisense-RNA:t voivat olla mukana geeniekspression säätelyssä ei vain transkription aloitusvaiheessa, vaan myös sen pidentymisessä ja lopettamisessa. Esimerkiksi kaksisuuntaista transkriptiota tapahtuu joskus prokaryooteissa ja eukaryooteissa, kun kaksi RNA-polymeraasia lukee saman geenin vastakkaisista juosteista. Lopulta ne törmäävät, mikä johtaa transkription ennenaikaiseen päättymiseen. Vaikka polymeraasit liikkuvat hitaasti eivätkä todennäköisesti törmää, ne voivat pysähtyä ja lopettaa transkription pidentymisen ennenaikaisesti, mikä myös johtaa geenien hiljentymiseen. Tällä mekanismilla antisense-RME2-RNA tukahduttaa IME4-geenin. Antisense-RNA:t voivat myös häiritä silmukointia . Esimerkiksi ZEB2 mRNA:n translaatio vaatii IRES : n , joka sijaitsee yhdessä introneista . Kun tämän geenin antisense-RNA ilmentyy, se peittää silmukointikohdan, mikä estää IRES:n poistamisen transkriptista, mikä mahdollistaa tehokkaan translaation. Lopuksi antisense-RNA:n ilmentymistaso voi vaikuttaa siihen, mitkä sense-transkriptin isoformit syntetisoidaan [1] .

Antisense-RNA:t voivat toimia transkription jälkeen, nimittäin suoraan vaikuttaa kohde-mRNA:n translaatioon. Ne voivat estää ribosomien pääsyn mRNA:han tai houkutella RNaasi H:ta mRNA:han. Joskus antisense-RNA:illa on kuitenkin positiivinen vaikutus translaatioon [1] .

Lääketieteellinen merkitys

Hyvin spesifisesti vaikuttavina säätelyelementteinä antisense-RNA:t voivat olla lupaavia lääkekohteita. Lisäksi tarvitaan hyvin vähän antisense-RNA- molekyylejä halutun vaikutuksen saavuttamiseksi , mikä tekee niistä vieläkin kätevämpiä kohteita. Ajatusta kohdegeenin ilmentymisen spesifisestä lisääntymisestä vastaavan antisense-RNA:n suppressiosta johtuen kehitetään aktiivisesti. Lääkkeiden suunnittelusta johtuen [ inhibiittori on paljon helpompi luoda kuin aktivaattori. Joissakin tapauksissa on kuitenkin tarpeen lisätä kohdegeenin, esimerkiksi kasvainsuppressorigeenin, ilmentymistä. Tämä voidaan saavuttaa suppressoimalla vastaava antisense-RNA. Lisäksi tapauksissa, joissa kohdegeenin suppressiota vaaditaan, antisense-RNA voi itse toimia terapeuttisena aineena. RNaasit tuhoavat kuitenkin nopeasti soluun tuodut RNA:t, joten niitä on suojeltava hajoamiselta. Useimmiten tämä saavutetaan kemiallisilla modifikaatioilla, kuten lisäämällä fosforotioaattia . Fosforotioaattimuunnos voi kuitenkin aiheuttaa tulehdusta . Lisäksi antisense-RNA:illa voi olla erittäin vakavia sivuvaikutuksia. Endogeenisten antisense-RNA:iden spesifisyydestä huolimatta vain 10–50 % synteettisistä oligonukleotideista vaikuttaa kohdegeeniin. Tämä johtuu luultavasti siitä tosiasiasta, että antisense-RNA:iden luontaisella spatiaalisella rakenteella on tärkeä rooli kohteen tunnistamisessa ja suojauksessa RNaaseja vastaan. Vain yhden nukleotidin korvaaminen voi muuttaa suuresti molekyylin rakennetta ja vaikuttaa sen vuorovaikutukseen kohteen kanssa. Lopuksi keinotekoiset antisense-RNA:t tunkeutuvat soluihin erittäin huonosti. Neuronit ja gliasolut imevät onnistuneesti paljaita oligonukleotideja, mutta antisense-RNA:iden toimittaminen muun tyyppisiin soluihin vaatii erityisten kantajien, kuten lipidirakkuloiden tai erityisten virusten , kehittämistä [2] .

Tällä hetkellä käytetty antisense-RNA-lääke on mipomerseeni , jonka FDA on hyväksynyt vuonna 2013. Se kehitettiin säätelemään kolesterolia sisältävien matalatiheyksisten lipoproteiinien pitoisuutta potilaiden veressä, jotka kärsivät homotsygoottisesta familiaalisesta hyperkolesterolemiasta , joka on harvinainen autosomaalisesti hallitseva geneettinen sairaus [10] .

Katso lisätietoja artikkelin RNA-terapia kirjallisuudesta ).

Muistiinpanot

1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 Pelechano V. , Steinmetz LM Geenin säätely antisense-transkriptiolla.  (englanniksi)  // Luontoarvostelut. genetiikka. - 2013. - joulukuu ( osa 14 , nro 12 ). - s. 880-893 . doi : 10.1038 / nrg3594 . — PMID 24217315 .
2. ↑ 1 2 3 Wahlestedt C. Kohdistus pitkälle ei-koodaavalle RNA:lle terapeuttisesti geeniekspression lisäämiseksi.  (englanniksi)  // Luontoarvostelut. huumeiden löytö. - 2013. - Kesäkuu ( osa 12 , nro 6 ). - s. 433-446 . - doi : 10.1038/nrd4018 . — PMID 23722346 .
3. ↑ Weiss B. , Davidkova G. , Zhou LW Antisense RNA -geeniterapia biologisten prosessien tutkimiseen ja modulointiin.  (englanti)  // Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. - 1999. - maaliskuu ( osa 55 , nro 3 ) . - s. 334-358 . - doi : 10.1007/s000180050296 . — PMID 10228554 .
4. ↑ 1 2 3 Saberi F. , Kamali M. , Najafi A. , Yazdanparast A. , Moghaddam MM Luonnolliset antisense-RNA:t mRNA:n säätelyelementteinä bakteereissa: katsaus toimintaan ja sovelluksiin.  (englanti)  // Cellular & Molecular Biology Letters. - 2016. - Vol. 21 . - s. 6-6 . - doi : 10.1186/s11658-016-0007-z . — PMID 28536609 .
5. ↑ Kole R. , Krainer AR , Altman S. RNA-terapiat: RNA-häiriöiden ja antisense-oligonukleotidien lisäksi.  (englanniksi)  // Luontoarvostelut. huumeiden löytö. - 2012. - 20. tammikuuta ( nide 11 , nro 2 ). - s. 125-140 . - doi : 10.1038/nrd3625 . — PMID 22262036 .
6. ↑ Simons RW Luonnossa esiintyvä antisense-RNA-kontrolli – lyhyt katsaus.  (englanniksi)  // Gene. - 1988. - 10. joulukuuta ( nide 72 , nro 1-2 ). - s. 35-44 . — PMID 2468573 .
7. ↑ Ietswaart R. , Wu Z. , Dean C. Kukinta-ajan ohjaus: toinen ikkuna antisense-RNA:n ja kromatiinin väliseen yhteyteen.  (englanniksi)  // Trends In Genetics : TIG. - 2012. - syyskuu ( osa 28 , nro 9 ). - s. 445-453 . - doi : 10.1016/j.tig.2012.06.002 . — PMID 22785023 .
8. ↑ 1 2 3 4 Magistri M. , Faghihi MA , St Laurent G 3rd. , Wahlestedt C. Kromatiinin rakenteen säätely pitkillä ei-koodaavilla RNA:illa: keskity luonnollisiin antisense-transkripteihin.  (englanniksi)  // Trends In Genetics : TIG. - 2012. - elokuu ( nide 28 , nro 8 ). - s. 389-396 . - doi : 10.1016/j.tig.2012.03.013 . — PMID 22541732 .
9. ↑ Whetstine, Johnathan R. Histone Methylation // Handbook of Cell  Signaling . — Toiseksi. - s. 2389-2397. — ISBN 978-0-12-374148-6 . - doi : 10.1016/b978-0-12-374145-5.00287-4 .
10. ↑ Wong E. , Goldberg T. Mipomersen (kynamro): uusi antisense-oligonukleotidin estäjä homotsygoottisen familiaalisen hyperkolesterolemian hoitoon.  (englanniksi)  // P & T : Vertaisarvioitu lehti Formulary Managementille. - 2014. - Helmikuu ( osa 39 , nro 2 ). - s. 119-122 . — PMID 24669178 .