DNA - rokote (myös geenirokote , nukleiinihapporokote ) on geneettisesti muokattu rakennelma, joka soluun viemisenjälkeen varmistaa patogeeniproteiinien tai kasvainantigeenien tuotannon ja aiheuttaa immuunivasteen . DNA-rokotteiden viemistä kehoon kutsutaan geneettiseksi immunisaatioksi. DNA-rokotuksella on useita etuja perinteisiin rokotteisiin verrattuna. Erityisesti tällaisten rokotteiden on osoitettu tuottavan ei ainoastaan vasta-aineiden tuotantoa ( humoraalinen immuniteetti ), vaan myös spesifinen sytotoksinen vaste ( soluimmuniteetti ), joka oli aiemmin saavutettavissa vain elävillä rokotteilla . Nykyään DNA-rokotteita ei käytetä ihmisten hoitoon, mutta geneettisen immunisoinnin ennustetaan auttavan voittamaan monia sairauksia.
Ajatus DNA - fragmenttien käytöstä rokotuksiin syntyi 1950- ja 1960 -luvuilla . Useiden kokeiden jälkeen havaittiin, että DNA:n geneettinen informaatio säilyttää kykynsä transkriptoida ja transloida sen jälkeen, kun se on siirretty toiseen soluun [1] [2] . Samana vuonna havaittiin, että polioviruksen genomin vieminen eläimiin stimuloi vasta -aineiden tuotantoa [3] [4] . Myöhemmin humoraalisen immuniteetin aktivoituminen osoitettiin DNA-molekyyleille, jotka ovat peräisin ei-infektoivista aineista [5] . 90 -luvulta lähtien tieteelliset laboratoriot ovat alkaneet tutkia yhä enemmän DNA: n immunostimulatorisia ominaisuuksia . Vuonna 1992 Tang ja hänen kollegansa osoittivat, että plasmidiin upotettu ihmisen kasvuhormonigeeni ekspressoituu vakaasti hiirissä , ja immuunijärjestelmä tunnistaa syntetisoidun hormonin antigeeniksi ja stimuloi vasta-aineiden tuotantoa. Prosessia plasmidi-DNA:n lisäämiseksi humoraalisen immuniteetin stimuloimiseksi kutsui Tang "geneettiseksi immunisaatioksi" [6] . Kuitenkin seuraavana vuonna toinen tutkijaryhmä totesi, että influenssaviruksen proteiineja koodaavan plasmidin käyttöönotto aiheuttaa sekä humoraalisen että soluvasteen [7] . Molempien immuniteetin haarojen induktio samana vuonna havaittiin myös HIV-geenejä sisältävälle plasmidille [8] . Vuodesta 1995 lähtien on alkanut ilmaantua todisteita siitä, että DNA-rokote voi aktivoida immuunijärjestelmän syöpää vastaan [9] [10] . Noin 20 vuotta sitten tehtiin ensimmäiset kliiniset DNA-rokotteiden kokeet, joiden ennen kaikkea oli tarkoitus osoittaa uuden menetelmän turvallisuus. Potilaille injektoitiin HIV:n, influenssaviruksen, herpesin, hepatiitti B:n, malarian aiheuttajan, geenejä. Kaikkien testien tulokset olivat varsin rohkaisevia: DNA-rokotteet ekspressoituivat vakaasti, provosoivat immuunivasteen eivätkä aiheuttaneet vakavia sivuvaikutuksia, joista tuli sysäys niiden jatkotutkimukselle [11] .
Rakenteellisesti DNA-rokote on nukleotidisekvenssi, joka on upotettu vektoriin , joka koodaa tiettyä antigeeniä tai antigeenejä. Geenitekniikassa vektori on nukleiinihappomolekyyli, joka kuljettaa geneettistä materiaalia soluihin ja varmistaa sen replikaation tai ilmentymisen . Aikaisemmin geenien kuljettamiseen soluun käytettiin viruksiin perustuvia vektoreita: modifioitua (heikennettyä) variolavirusta , adenoviruksia ja retroviruksia . Virusvektorit ovat melko tehokkaita, mutta niillä on merkittävä sivuvaikutusten todennäköisyys, jotka liittyvät itse vektorin suhteellisen korkeaan immunogeenisyyteen. Siksi nykyään vektorina käytetään useimmiten bakteeriplasmidia - pientä stabiilia pyöreää DNA-molekyyliä, joka pystyy replikoitumaan itsenäisesti. Plasmidi ei itsessään aiheuta haluttua spesifistä immuunivastetta , vaan sitä varten siihen ommellaan immunogeenisten proteiinien geenit. Lisäksi DNA-rokotteen tulee sisältää säätelysekvenssit, jotka ovat välttämättömiä geenien ilmentymiseen eukaryoottisoluissa . Valmis DNA-konstrukti toimitetaan bakteerisoluun, jossa sen kopioiden määrää lisätään. Tätä seuraa halutun insertin kantavien plasmidien eristäminen ja puhdistaminen [12] .
Tärkeä vaihe DNA-rokotteiden luomisessa on vektorin suunnittelu (konstruointi). Plasmidivektorin vaaditut rakenteet ovat restriktiokohdat , selektiomarkkeri ja DNA-rokotteen replikaation aloituskohta bakteerisolussa . Jotta antigeenisynteesi tapahtuisi , DNA-rokotteen on sisällettävä promoottori ja polyadenylaatiosignaali. Promoottori on tärkeä tekijä rokotteen tehokkuudessa, koska se määrää immuunivasteen voimakkuuden : mitä enemmän virus- tai kasvainantigeeniä koodaava geeni ilmentyy , sitä vahvempi immuunivaste. Yleisimmin käytetty promoottori on SV40-virus tai sytomegalovirus (CMV). mRNA -transkriptien stabiloimiseksi polyadenylaatiosignaali, joka on useimmiten peräisin naudan kasvuhormonin (BGH) geenistä tai SV40-viruksesta , insertoidaan plasmidiin . Bakteerien antibioottiresistenssigeenit valitaan selektiivisiksi markkereiksi ; usein tämä on kanamysiiniresistenssigeeni. DNA-rokotteita suunniteltaessa suosituin Escherichia colin replikaation alkupiste [13] .
Vektori on tärkeä DNA-rokotteen komponentti, mutta sen immunogeenisuuden määrää tarkasti insertti, antigeeniä koodaava DNA-sekvenssi. Virusantigeeneistä fuusioproteiinit soveltuvat parhaiten immunisaatioon; nämä ovat suhteellisen konservoituneita proteiineja, jotka mahdollistavat viruksen pääsyn soluun. Gram-positiivisia bakteereja vastaan annettaessa on suositeltavaa liittää plasmidivektoriin niiden bakteeriproteiinien geenit, jotka määrittävät taudin patogeneesin . Gram-negatiivisten bakteerien proteiinien joukossa poriineilla on korkea immunogeenisyys [14] . Terapeuttisissa antituumori-DNA-rokotteissa käytetään syöpäsolumarkkeriproteiineja [ 15] .
Valmis rokote on toimitettava ihmisen tai eläimen elimistöön, jossa sen kohteena ovat antigeeniä esittelevät solut (APC) - makrofagit , dendriittisolut , B-lymfosyytit . Täällä tapahtuu antigeenin synteesi ja translaation jälkeinen modifikaatio, jonka jälkeen se viedään solukalvoon immuunijärjestelmän huomion kiinnittämiseksi . Pääongelmana on toimittaa riittävä määrä plasmidia APC:hen. Menetelmät geneettisen materiaalin kuljettamiseksi soluun jaetaan yleensä kahteen ryhmään: virusperäisiin ja ei-viraalisiin. Koska virusvektoreilla on useita merkittäviä haittoja, tässä osassa esitetään vain ei-viraalisia menetelmiä DNA-rokotteiden antamiseksi.
Adenoviruksen kanssa
Osana lipoplexia
1990-luvun alussa lihaksensisäiset mikroinjektiot olivat yleisin tapa viedä DNA:ta soluun menetelmän yksinkertaisuuden vuoksi. Tätä varten DNA liuotetaan veteen tai isotoniseen liuokseen , tarvittaessa lisätään adjuvanttia (aine, joka tehostaa immuunivastetta ). Sitten liuos ruiskutetaan ohuella lasiputkella lihaskudokseen , jossa dendriittisolut suorittavat APC:n roolin . Dendriittisolun ytimeen päästyään rokote alkaa ilmentyä ja tapahtuu proteiinien - antigeenien synteesi . Mikroinjektioiden avulla DNA:ta voidaan injektoida myös ihonalaisesti, kateenkorvaan , maksaan , kasvainkudokseen [ 16] , mutta juuri lihaskudoksessa havaitaan pisin (jopa vuosi) DNA-rokotteen ilmentyminen. 17] .
Langerhans-solujen ( dendriittisolujen alatyyppi ) suuren pitoisuuden vuoksi iho on houkutteleva kohde DNA-rokotteelle [18] . Ihonsisäiseen (subkutaaniseen) antamiseen käytetään joukkoa mikroneuloja , joiden pituus on useita satoja mikroneja. Intradermaaliselle rokotteelle on olemassa useita vaihtoehtoja. Yksinkertaisin tapa on irrottaa sarveiskerros (ihon ulkokerros, yleensä 10-20 µm) mikroneuloilla sen läpäisevyyden lisäämiseksi DNA-liuoksen jatkoinjektiota varten. Tehokkaampaa on käyttää kuivarokotteella päällystettyjä mikroneuloja, jotka liukenevat jo ihon alle [19] .
Tämän menetelmän tehokkuus on yleensä alhainen, koska DNA tulee ensin solujen väliseen tilaan ja vasta sitten sisällytetään soluihin .
Elektroporaatio on perinteinen tapa DNA:n toimittamiseen bakteerisoluihin ja soluviljelmiin , joka perustuu sähköimpulssin käyttöön . Tällainen impulssi luo huokosia solukalvoon, mikä helpottaa negatiivisesti varautuneen DNA:n sisäänpääsyä. Tämä menetelmä on otettu käyttöön DNA-rokotteiden toimittamiseen eläimille ja ihmisille, ja se voi merkittävästi lisätä tavanomaisen injektion tehokkuutta. Elektroporaatiolaitteessa on sähkövirran lähde ja kertakäyttöinen ritilä, joka koostuu ruiskusta ja neulaelektrodeista. Ruisku ruiskuttaa rokotteen lihaskudokseen ja elektrodit luovat sähkökentän, joka helpottaa DNA:n pääsyä myosyytteihin ja dendriittisoluihin . Tähän mennessä on kehitetty laitteita, jotka voivat lisätä rokotuksen tehokkuutta 1000 kertaa tavanomaiseen injektioon verrattuna. Elektroporaatiota voidaan käyttää DNA-rokotteen antamiseen sekä lihakseen että ihon alle. Haittoja ovat lievä kipu pistoskohdassa, erikoislaitteiden tarve [18] . Sähkökentän sijasta voidaan käyttää magneettikenttää . Tällaiset laitteet toimivat samalla periaatteella, mutta tässä tapauksessa toimenpide on täysin kivuton ja vähemmän vaurioittava soluille [20] .
Sähkökentän vaikutus ei ainoastaan lisää DNA-rokotteen imeytymistä soluihin, vaan myös stimuloi immuunivasteen kehittymistä. Elektroporaation käyttö johtaa vähäisiin kudosvaurioihin - kehittyy paikallinen tulehdusprosessi. Vaurioituneet solut vapauttavat kemokiineja , joten niihin lähetetään makrofageja , lymfosyyttejä ja dendriittisoluja . Immuunisolujen pitoisuuden lisääminen pistoskohdassa lisää rokotteen tehokkuutta [21] .
Sonoporaatio on menetelmä vieraan DNA:n siirtämiseksi soluihin ultraäänellä . Ultraääni lisää solukalvon läpäisevyyttä, minkä seurauksena eksogeeninen DNA tunkeutuu soluun helpommin. Ensimmäistä kertaa sonoporaatiota geenin siirtämiseksi soluun sovellettiin vuonna 1986 [22] . Tätä menetelmää käytetään DNA-molekyylien viemiseen sarveiskalvon , aivojen , luukudoksen , munuaisten , haiman , alkiokudoksen , luuranko- ja sydänlihasten soluihin . Muihin menetelmiin verrattuna sonoporaatiota on tutkittu vähän, sen tehokkuuden parantaminen vaatii paljon enemmän ponnistuksia, erityisesti koko organismin tasolla [16] .
Ballistinen transfektio perustuu elinten ja kudosten kuorimiseen (pommitukseen) raskasmetallien ( kulta , volframi ) mikrohiukkasilla, joiden halkaisija on 1-3 mikronia ja jotka on peitetty DNA - molekyylillä . Tällä tavalla annettu DNA-rokote ilmentyy kohdesoluissa ja niiden tuotteet kulkeutuvat verenkiertoon. Hiukkasten kiihtyvyyden antamiseksi käytetään pienaseiden kaltaista laitetta - geenipistoolia tai geenipyssyä . Mikrohiukkaset kulkevat solukalvojen läpi ja kuljettavat geneettisen rakenteen suoraan solun tumaan . Mikrohiukkasten tunkeutumissyvyys on yleensä pieni - jopa 1 mm, joten menetelmää käytetään pääasiassa ihon tai viereisen rustokudoksen transfektioon . Erityiset kuoriutumisolosuhteet mahdollistavat mikrohiukkasten tunkeutumisen 4-5 mm:n syvyyteen ja siirtää geenirakenteita poikkijuovaisiin lihaskuituihin . Yleensä solut, jotka sijaitsevat suoraan laukauksen keskellä, kuolevat, kun taas menestyneimmät protransformoidut solut sijaitsevat vyöhykkeellä 0,6-1 cm keskustasta. Tätä tekniikkaa kutsutaan myös bioballistiksi tai biolistiikaksi [23] .
Ensimmäisen geenipyssyn loi tiedemiesryhmä vuosina 1983-1986 tarkoituksenaan muuttaa kasvisoluja. Se oli automaattisesta naulaimesta kehitetty pistooli. DNA, jossa oli reportteri (markkeri) geeni, levitettiin volframipalloon ja poltettiin petrimaljaan . Reportterigeenin ilmentyminen osoitti immunisaation tehokkuuden. Nykyään kulta- tai hopeahiukkasia käytetään DNA:n toimittamiseen , koska ne eivät ole myrkyllisiä soluille, toisin kuin volframi [24] .
Vuonna 1999 kehitettiin injektiolaitteita, jotka pystyvät antamaan DNA-rokotteen ilman neulaa [25] . Tällaiset laitteet toimivat Lorentzin voiman ansiosta : pieni voimakas magneetti luo merkittävän paineen, laukaisee männän , joka työntää lääkkeen äänen nopeudella [16] . Muuttamalla virran voimakkuutta voit valita injektion syvyyden ja annostella lääkkeet. Toimenpide on täysin kivuton ja sitä on aiemmin käytetty insuliinin antamiseen diabeetikoille ja laajamittaisissa rokotuksissa . Tämän menetelmän merkittävä haittapuoli on, että korkea paine voi teoriassa muuttaa injektoitujen molekyylien rakennetta [26] . Tätä injektiotekniikkaa kuitenkin kehitetään edelleen, ja nykyään on kehitetty laitteita, jotka voivat kuljettaa DNA:ta jopa 16 mm:n syvyyteen [27] .
Elävät bakteerivektorit ovat Salmonella- , Shigella- tai Listeria -kantoja, jotka sisältävät mutaatioita biosynteesi- tai invaasiogeeneissä , jotka eliminoivat niiden patogeenisyyden ja kyvyn selviytyä isännässä tai ympäristössä. Sen sijaan halutut immunogeeniset proteiinigeenit liitetään bakteerigenomiin. Heikentynyt bakteeri viedään elimistöön suun kautta (suun kautta , nielemällä) tai nenänsisäisesti (ruiskeena nenäaukkoon ), joten tämä rokotusmenetelmä ei vaadi välineitä. Lisäksi tällainen anto stimuloi limakalvon immuunivastetta , mikä on tärkeää, koska useimmat patogeenit pääsevät kehoon suun ja nenän aukkojen kautta. Ohita vatsa , heikentynyt bakteeri pääsee ohutsuoleen . Lisäksi bakteeri tunkeutuu Peyerin laastareihin - suolen imusolmukkeisiin . Kun bakteerit ovat Peyerin laastarien keskellä, niistä tulee makrofagien kohde ja ne käyvät läpi fagosytoosin . Makrofagien sytoplasmassa bakteeri vapauttaa DNA - rokotteen, jonka jälkeen DNA siirtyy tumaan ja immuunijärjestelmä tekee bakteerista vaarattoman [18] [28] .
Liposomi - pallomainen muodostus (halkaisijaltaan noin 100 nm), joka koostuu kaksoislipidikerroksesta . Liposomien sisällä on ontelo, joka on yleensä täytetty liuottimella, mutta sitä voidaan käyttää erilaisten aineiden, mukaan lukien DNA-rokotteiden, kuljettamiseen. Niiden hydrofobinen kuori mahdollistaa niiden sulautumisen solukalvojen kanssa ja kuljettaa niiden sisällön soluun. Liposomien käyttö aloitettiin vuonna 1965, ja siitä tuli voimakas moottori bionanoteknologian kehitykselle [29] .
Lupaava menetelmä DNA-rakenteen viemiseksi suoraan kohdesoluihin on geneettisen konstruktin kuljettaminen osana positiivisesti varautuneista lipideistä rakennettuja kationisia liposomeja. Kationiset liposomit, joissa on negatiivisesti varautunut DNA-molekyyli, muodostavat DNA-lipidikompleksin - lipoplexin. Tällaisten kompleksien käytön etuja ovat kyky kuljettaa suuria määriä tietoa, tarttumattomuus, lisäksi ne ovat yksinkertaisia ja edullisia valmistaa [30] . Vuonna 2003 luotiin äärimmäisen pieniä, millimikronin kokoisia polyetyleeniglykolipolymeerillä päällystettyjä liposomeja , jotka pystyvät kuljettamaan terapeuttista DNA:ta veri-aivoesteen läpi ja toimittamaan sen aivohermosoluille , mikä oli aiemmin mahdotonta [31] .
Polyplekseja, järjestelmiä, jotka koostuvat positiivisesti varautuneista polymeereistä ( polykationeista ) ja negatiivisesti varautuneista DNA-molekyyleistä, käytetään suurten DNA-rakenteiden (>10 kb ) viemiseen soluun. Tällaisten kompleksien koko on alle 100 nm, mikä toisaalta ei salli niiden pilkkomista makrofagien toimesta (koska ne reagoivat yli 200 nm:n hiukkasiin), ja toisaalta ne ovat riittävän suuria. suodatetaan munuaisissa [32] .
Polykationit kondensoivat DNA-molekyylin komplekseiksi ja varmistavat siten sen stabiilisuuden ja suojan nukleaasien vaikutukselta . Kationiset proteiinit, synteettiset aminohappohomopolymeerit (polylysiinit, polyarginiinit), kitosaanipolysakkaridi , polyetyleeniamiini voivat toimia DNA:ta sitovina polymeereinä . Yleensä polykationia on ylimäärä polypleksien koostumuksessa, minkä seurauksena tämä kompleksi on liukoinen ja positiivisesti varautunut. Jos polypleksiin ommellaan ligandi tietylle solureseptorille , DNA-rokote voidaan ohjata tiettyyn solutyyppiin. Geneettisen materiaalin toimitusprosessi polypleksien koostumuksessa sisältää kaksi vaihetta: solunulkoinen (polku injektiokohdasta kohdesoluihin) ja solunsisäinen (vuorovaikutus kohdesolujen kanssa, endosytoosi , poistuminen endosomeista , toimitus tumaan). Ensimmäinen este, joka kompleksin on voitettava, on veri ja solunulkoinen matriisi . Siksi polypleksin sellaiset fysikaalis-kemialliset parametrit valitaan sen stabiilisuuden lisäämiseksi, ei-toivottujen vuorovaikutusten välttämiseksi veren proteiinien kanssa ja polykationin kemiallisen luonteen aiheuttaman immuunivasteen. Kohdesoluissa polypleksi adsorboituu plasmakalvoon ja absorboituu endosytoosiin, minkä jälkeen sen on poistuttava endosomista ja hajottava kationiseksi polymeeriksi ja DNA - molekyyliksi . Vapaa DNA lähetetään ytimeen, ja kationinen polymeeri poistuu solusta ja erittyy kehosta [33] .
| DNA-rokotteiden yleisimpien antomenetelmien ominaisuudet [16] [18] | ||
| Menetelmä | Edut | Vikoja |
| Lihaksensisäiset tai ihonalaiset injektiot |
|
|
| elektroporaatio |
|
|
| geeniase |
|
|
| Johdanto korkean paineen vuoksi |
|
|
| Pakkaus liposomeihin |
|
|
Solussa syntetisoitu antigeeni on prosessoitavissa , minkä jälkeen se esitellään immunokompetenteille soluille. Prosessointi on antigeenisen proteiinin jakamista immunogeenisiksi peptidifragmenteiksi. Esittely tarkoittaa antigeenifragmentin, joka on kytketty suuren histokompatibiliteettikompleksin (MHC) molekyyleihin, esittämistä immunokompetenteille soluille. Näitä molekyylejä on kaksi merkittävintä luokkaa: MHC-luokka I (MCG-I) ja MHC-luokka II (MCG-II). Sitoutuakseen kunkin luokan molekyyleihin antigeeni valmistetaan solun erityisissä osastoissa . Endogeeniset antigeeniproteiinit ohjataan proteasomiin hajoamista varten, minkä jälkeen ne esitetään kompleksina MHC-I:n kanssa solun pinnalla. Täällä, kun he kohtaavat, CD8+ T-solut ( T-tappajat ) tunnistavat heidät, jotka toteuttavat sytotoksisen immuunivasteen . Lysosomaaliset proteaasit pilkkovat eksogeeniset proteiinit , ne liitetään MHC-II:een ja CD4+ T-solu ( T-auttaja ) -reseptorit tunnistavat ne. Jälkimmäiset aiheuttavat sekä solu- että humoraalisia vasteita.
| Antigeenin prosessointireitit ja immuunivastemuodot | ||||
| Antigeenin lokalisointi | Pääkäsittelytyökalu | Antigeenia esittelevä kompleksi | Solut, jotka tunnistavat antigeeni-MHC-kompleksin |
immuunivaste |
|---|---|---|---|---|
| Häkissä | Proteasomi | GKG-I | T-tappajat | Sytotoksinen |
| Häkistä ulos | Lysosomi | GKG-II | T-auttajat | Solullinen, humoraalinen |
DNA-rokotukseen liittyy endogeeninen antigeenisynteesi , joten tämä reitti on hallitseva. Antigeenin prosessointi MHC-I-reittiä pitkin tapahtuu useissa vaiheissa. Tumassa syntetisoitunut proteiini kuljetetaan sytoplasmaan , proteasomi pilkkoo lyhyiksi peptideiksi - epitoopeiksi, jotka siirtyvät endoplasmiseen retikulumiin (ER) erityisten antigeeninkuljetusproteiinien ( TAP, antigeeninkäsittelyyn liittyvä kuljettaja ) avulla . EPR:ssä jokainen epitooppi on kytketty MHC-I-molekyyliin, minkä jälkeen muodostunut kompleksi lähetetään Golgin laitteeseen glykosylaatiota varten . Sieltä vesikkelin koostumuksessa oleva kompleksi lähetetään plasmakalvoon . Kun vesikkeli on fuusioitunut plasmalemman kanssa, kompleksi ilmestyy solun pinnalle, jossa T-tappajareseptorit, joilla on sytotoksista aktiivisuutta, tunnistavat sen [34] .
MHC-II:een sitoutuvien peptidien päälähde ovat eksogeeniset proteiinit, jotka ovat päässeet soluun endosytoosin kautta . On kuitenkin osoitettu, että jotkin solunsisäiset proteiinit voivat olla myös komplekseina MHC-II:n kanssa [35] . Samaan aikaan äskettäin syntetisoidut proteiinit siirtyvät sytoplasmaan tultuaan lysosomeihin , joissa antigeeni pilkkoutuu happamien proteaasien vaikutuksesta . Sen jälkeen lysosomi, joka sisältää epitoopit , fuusioituu rakkulaan , joka kantaa MHC-II-molekyyliä. Yhdistyneen vesikkelin sisällä muodostuu epitooppi-MHC-II -kompleksi, joka rakkulan fuusioitumisen jälkeen plasmalemman kanssa kulkeutuu solun pinnalle. Tässä T-auttajareseptorit tunnistavat tämän kompleksin , mikä johtaa niiden aktivaatioon. Tämä johtaa sekä solujen ( T-tappajien aktivaatio ) että humoraalisen immuniteetin ( B-lymfosyyttien aktivaatio) stimulaatioon .
Perinteinen rokotus liukoisilla proteiiniantigeeneillä tähtää T-auttajien mobilisointiin. Suhteellisen alhainen T-auttajavaste on yksi DNA-rokotteiden haitoista. Myöskään nykyinen DNA-rokotteiden sukupolvi ei pysty indusoimaan korkeiden vasta-ainetiitterien tuotantoa . T-auttaja-aktivaation lisäämiseksi antigeeni on ohjattava uudelleen MHC-II-reitille. Tätä varten DNA-rokotteeseen rakennetaan signaali lysosomaalisesta lokalisaatiosta: syntetisoitu antigeeni ohjataan lysosomeihin, mikä tarkoittaa, että se tulee MHC-II:n polulle [34] .
DNA-rokotteiden tulevaisuutta koskeva pääkysymys koskee niiden tehokkuuden lisäämistä. Tähän mennessä on tehty lukuisia tutkimuksia kehitettyjen DNA-rokotteiden optimoinnista. Ratkaisua etsitään kahdessa suunnassa: lisäämällä rokotteen ilmentymistä ja lisäämällä koodatun antigeenin immunogeenisyyttä.
DNA-rokotteen tärkeä osa on promoottori . Bakteeripromoottorit eivät sovellu antigeenin ilmentämiseen nisäkässoluissa , joten sen sijaan on käytetty onkogeenisten virusten promoottoreita. Rokotteiden turvallisuuden parantamiseksi ne on nyt korvattu ei-karsinogeenisistä esineistä, kuten ihmisen sytomegaloviruksesta (CMV), olevilla promoottoreilla. Useimmille DNA-rokotteille tämä promoottori on optimaalinen valinta: se ekspressoituu voimakkaasti useissa soluissa. Geenin ilmentymiseen tietyissä kudoksissa on lupaavaa käyttää tämän tyyppisille kudoksille spesifisiä promoottoreita. Esimerkiksi lihaskreatiinikinaasipromoottorin käyttö lihakseen annettuna johtaa kymmenkertaiseen lisääntymiseen vasta- ainesynteesissä ja T-soluvasteen indusoinnissa kuin samanlaisen DNA-rokotteen käyttö CMV-promoottorin kanssa. Desmiinigeenin promoottori , joka koodaa yhtä sytoskeletaalin proteiineista, osoitti myös korkeaa tehokkuutta myosyyteissä . DNA-rokotteen ilmentymisen lisäämiseksi keratinosyyteissä ( epiteelisoluissa ) käytetään metallotioneiinigeenin ( raskasmetalleja sitova proteiini ) tai D3 -vitamiinihydroksylaasigeenin [13] [36] promoottoreita .
Transkription aloitustasoa nostetaan yleensä käyttämällä vahvaa promoottoria ja tehostajia , ja lopetusominaisuuksista voi tulla rajoittava tekijä. Polyadenylaation ja primaarisen RNA-transkriptin prosessoinnin tehokkuus vaihtelee riippuen polyA-signaalin sekvenssistä . Toisin sanoen polyadenylaatiosekvenssi vaikuttaa antigeenisynteesiin. Esimerkiksi SV40-viruksen laajalti käytetty polyA-signaali on vähemmän tehokas kuin kanin β-globiinigeenin tai naudan kasvuhormonigeenin polyadenylaatiosignaali [13] .
Tehokasta translaatiota varten nisäkkään mRNA:lla täytyy olla niin kutsuttu Kozak-sekvenssi . Tämän sekvenssin lisääminen DNA-konstruktioon voi merkittävästi lisätä antigeenisynteesin tasoa. Jotta RNA-polymeraasi ei ohita geenin lopetuskodonia ja estäisi pitkänomaisen proteiinin synteesiä, jota ei voida sitten laskostaa oikein, geeni voidaan päättää kaksoislopetuskodonilla [36] .
DNA-rokotetta suunniteltaessa he yrittävät myös optimoida sen kodonit . Optimointimenettely tarkoittaa geenisekvenssin rajojen muuttamista siten, että proteiinin aminohapposekvenssi ei muutu, mutta sen mRNA:n translaation tehokkuus kasvaa. Syynä on se, että useimpia aminohappoja koodaa useampi kuin yksi kodoni. Jokaisella kodonilla on oma tRNA , ja eri tRNA:iden esitys solussa ei ole sama, ja se vaihtelee myös organismin tyypistä riippuen. Kodonit valitaan siten, että halutun tRNA:n läsnäolo antigeenisynteesin aikana ei tule rajoittavaksi tekijäksi [13] [37] .
Vaikka immuunivasteen voimakkuus korreloi DNA-rokotteen ilmentymistason kanssa, jokaisella antigeenillä on tietty tasanne, jonka jälkeen antigeenisen proteiinin määrän kasvu ei lisää vasta-ainetuotantoa. Samaan aikaan vahvempi immuunivaste voidaan saavuttaa optimoimalla antigeeni [38] . Esimerkiksi yhdistämällä antigeeni ligandin kanssa spesifiseen antigeeniä esittelevän solun (APC) reseptoriin . Tällainen ligandi voi olla CD40-markkeriproteiini, Fms:n kaltaisen tyrosiinikinaasi-3:n solunulkoinen domeeni tai T-tappaja -antigeeni-4 [39] . Ligandi-reseptorin vuorovaikutuksesta johtuen APC:n antigeenisen proteiinin sieppauksen tehokkuus kasvaa.
Antigeenin hajoamisen helpottaminen proteasomissa tai lysosomissa stimuloi myös immuunivastetta. Antigeenin protelioottisen pilkkomisen tehostamiseksi sen sekvenssiin lisätään ubikvitinaatiosignaali [34] . DNA:ta koodaavien rokotteiden käyttö koko antigeenin, useiden eri alkuperää olevien epitooppien, sijaan voi merkittävästi laajentaa immuunivasteen kirjoa [38] .
Tuumori-DNA-rokotteisiin yhdistelmä "kasvainantigeeni + virus- tai bakteeriantigeeni" on tehokas. Esimerkiksi kasvainantigeenin yhdistelmä tetanustoksiinin epitoopin kanssa lisää merkittävästi tappaja-T-solujen aktivaatiota syöpäsoluja vastaan [40] [41] .
Kun käytetään perinteisiä rokotteita , niihin lisätään adjuvantteja immuunivasteen lisäämiseksi . DNA-rokote on bakteerialkuperää, joten se on itsessään immunostimulantti . Immuunivasteen tehostamiseksi adjuvanttigeenejä lisätään DNA-rokotteeseen tai käytetään lisäplasmidia , joka koodaa immunostimulatorisia proteiineja [42] .
Bakteerien CpG-dinukleotidien immunostimuloiva vaikutusPlasmidin toiminta ei rajoitu geenien kuljettamiseen soluihin. Vuonna 1893 havaittiin, että bakteerilysaattien seos vähentää syöpäkasvainten etenemistä, mutta vasta vuonna 1983 todettiin, että lysaatin immunostimuloivat ominaisuudet johtuvat bakteerien DNA-molekyyleistä [43] . Vuonna 1995 osoitettiin, että immuunistimulaatio johtuu bakteeri-DNA:n CpG-motiiveista [44] . Bakteereissa, kuten myös DNA-viruksissa, nämä motiivit ovat metyloitumattomia . Ihmisillä ja korkeammilla kädellisillä päinvastoin sytosiini sisältää useimmissa CpG-dinukleotideissa metyyliryhmän . Siksi ihmiskeho havaitsee metyloitumattomat CpG-motiivit patogeeneihin liittyvinä molekyylikuvioina ( PAMP ). PAMP-yhdisteet tunnistavat maksun kaltaiset reseptorit , jotka ligandityypistä riippuen jaetaan useisiin tyyppeihin. Metyloimattomat CpG-motiivit tunnistaa B-lymfosyyttien , dendriittisolujen ja luonnollisten tappajasolujen endoplasmisen retikulumin kalvoilla sijaitseva TLR-9- reseptori . Reseptorin sitoutuminen metyloitumattomiin CpG-motiiveihin laukaisee reaktiosarjan, joka indusoi tulehdusta edistävien sytokiinien – interferoni-1:n ja IL-12 :n – synteesiä [45] .
Sytokiinien ja muiden immunomodulaattoreiden ilmentyminenDNA-rokotuksissa adjuvantteina käytetään useimmiten sytokiinigeenejä. Sytokiinit ovat luokka proteiinimolekyylejä , jotka säätelevät solujen ja järjestelmien välisiä vuorovaikutuksia kehossa, erityisesti immuunijärjestelmän toimintaa . Kaikki sytokiinit, ja yli 30 tunnetaan, voivat moduloida immuunivastetta . Sytokiineilla IL2, IL-12, interferoni y, IL-15, IL-18 ja IL-23 on stimuloiva vaikutus ensimmäisen luokan T-auttajiin . Sytokiineihin, jotka moduloivat luokan II T-auttajien toimintaa, kuuluvat: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 ja IL-13. Sytokiinin tyyppi valitaan sen mukaan, minkä tyyppistä immuunivastetta halutaan tehostaa [46] .
| Erot T-auttajaluokan 1 ja 2 immuunivasteessa | ||
| Erot | T-auttajat 1 | T-auttajat 2 |
|---|---|---|
| Pääsolun kumppani | Makrofagit | B-solu |
| immuunivaste | Matkapuhelin . Tehostaa makrofagien toimintaa |
Huumoria .
Stimuloi B-solujen lisääntymistä |
On mahdollista saavuttaa immuunivasteen lisääntyminen kemokiinien avulla. Kemokiinit ovat sytokiiniperhe , joka voi aiheuttaa herkkien solujen, mukaan lukien immuunisolujen, kemotaksia . Erityisesti kemokiinireseptoreita löytyy antigeeniä esittelevistä kemokiinisoluista . Kemokiinin sitoutuminen reseptoriinsa johtaa APC:n sisällä olevan antigeeni-kemokiinikompleksin endosytoosiin. Tätä strategiaa käytetään tehokkaasti sekä antiviraalisten DNA-rokotteiden [47] että kasvainten vastaisten rokotteiden [ 48] kehittämisessä .
Adjuvanttitoiminnon voi suorittaa myös HSP70-proteiini ( lämpösokkiproteiinit , HSP ) . HSP70:n immunostimulatorinen vaikutus perustuu sen kykyyn päästä solunulkoiseen tilaan ja sitoutua APC-reseptoreihin. HSP70:n uloskuljetuksen mekanismia ei ole vielä täysin selvitetty, mutta todennäköisesti on olemassa useita tapoja - eksosytoosi , erittyminen ulos tai poistuminen kanavan kautta [49] . HSP70:n sitoutuminen reseptoriinsa johtaa dendriittisolujen aktivaatioon , välittää antigeenin esittelyä ja stimuloi kemokiinin tuotantoa. Koska antigeeni on fuusioitu HSP70:een, se pääsee myös solunulkoiseen tilaan, joten se voidaan esitellä MHC-II-reitin kautta ja aktivoida B-soluja . Autoimmuunireaktioiden välttämiseksi DNA-rokotteet käyttävät bakteerigeeniä HSP70 [50] .
DNA-rokotusmenetelmällä on useita etuja, joista tärkein on sekä humoraalisten että solujen immuunivasteiden laukaiseminen . DNA-pohjaiset rokotteet tarjoavat pitkäaikaisen antigeenin ilmentymisen ja vastaavasti vakaan immuunivasteen. Muita DNA-immunisaation kehittymiseen vaikuttavia tekijöitä ovat rokotteen valmistuksen yksinkertaisuus ja alhaiset kustannukset [51] .
| Edut | Vikoja |
|---|---|
|
|
Kaikki neljä Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkeviraston hyväksymää rokotetta perustuvat plasmideihin . Kolmelle niistä valmistaja suositteli antotapaa - lihakseen, LifeTide-rokotteeseen - lihakseen yhdistettynä elektroporaatioon . Jos muut rokotteet on suunnattu immuunijärjestelmän aktivoimiseen, niin LifeTide-rokotteella immunostimuloiva vaikutus on ylimääräinen. Rokotteen tuote on somatoliberiini , hormoni, joka stimuloi kasvuhormonin ja prolaktiinin vapautumista aivolisäkkeestä . Kahden viimeisen hormonin vaikutus sioissa johtaa eläinten massan kasvuun ja pentueiden määrän kasvuun [52] . Samaan aikaan somatoliberiinia koodaavan plasmidin vieminen eläimiin stimuloi T-lymfosyyttien , luonnollisten tappajien [53] tuotantoa ja lisää siten kehon immuunivastetta.
| Rokotteen tuotemerkki | Lisenssin vuosi | Kohde | Eläin | Rokotetuote | Rokotteen tarkoitus |
|---|---|---|---|---|---|
| West Nile Innovator ( USA ) Arkistoitu 4. lokakuuta 2013 Wayback Machinessa | 2005 | Länsi-Niilin virus | Hevoset | PreM-E-viruksen rakenneproteiini | Suojaus virukselta |
| "Apex-i-h-en" ( Kanada ) Arkistoitu 4. lokakuuta 2013 Wayback Machinessa | 2005 | Hematopoieettisen kudoksen tarttuvan nekroosin (IGT) aiheuttaja | Lohi perheen kala | Viruksen glykoproteiini | Kalanruoan määrän ja laadun lisääminen |
| LifeTide S-Double 5 ( Australia ) Arkistoitu 9. joulukuuta 2012 Wayback Machinessa | 2008 | Kasvuhormoni | Siat ja muut karjat | Sian somatoliberiini | Emakoiden kuivikkeiden lisääntyminen; vähentää merkittävästi perinataalista kuolleisuutta ja sairastuvuutta |
| "ONSEPT" ( USA ) | 2010 | Melanooma | koirat | Ihmisen tyrosinaasi | Vaihtoehtona sädehoidolle ja leikkaukselle melanooman hoidossa |
Vaikka solujen ja humoraalisten immuunivasteiden induktio on vakuuttavasti osoitettu tartuntatauteihin liittyville vieraille antigeeneille, DNA-rokotteiden käyttö syövän hoidossa on toistaiseksi ollut vähemmän menestyksellistä. Tehokkaan tuumoriimmuniteetin aikaansaaminen on vaikea tehtävä. Kliiniset tutkimukset ovat vahvistaneet kasvainten vastaisten DNA-rokotteiden yleisen turvallisuuden ja alhaisen toksisuuden, mutta niiden aiheuttaman immuunivasteen tehokkuus osoittautui heikoksi ja kasvainten vastainen aktiivisuus oli joissakin tapauksissa yleisesti kyseenalainen [39] .
Viimeisten 30 vuoden aikana on kaupallistettu seitsemän rokotetta hepatiitti B -tartunnan estämiseksi. Ne kaikki luottavat jonkin viruksen vaippaproteiinin käyttöön, jota kutsutaan pinta-antigeeniksi tai HBsAg :ksi .
Rokote koostuu kolmesta rokoteruiskeesta riittävän selvän immuunijärjestelmän uudelleenorganisoimiseksi. Toinen injektio annetaan kuukauden kuluttua ensimmäisestä annoksesta ja kolmas injektio kuuden kuukauden kuluttua ensimmäisestä annoksesta [55] Rokotuksen jälkeen hepatiitti B:n pinta-antigeeni voidaan saada havaittu veren seerumissa jopa useiden päivien ajan; tätä kutsutaan rokoteantigenemiaksi. Sen jälkeen immuunijärjestelmän vasta-aineita HBsAg :lle ilmaantuu verenkiertoon . Nämä vasta-aineet tunnetaan nimellä anti-HBsAg . Siitä lähtien nämä vasta-aineet ja immuunijärjestelmän muisti tarjoavat immuniteetin B-hepatiittitartunnalle. [56]
DNA-rokote COVID-19:ää vastaanInovio Pharmaceuticalsin valmistama INO-4800 DNA-rokote on parhaillaan vaiheen I-II kliinisissä kokeissa [57] [58] . Anti-covid- DNA-rokotteet AG0301-COVID19, ZyCoV-D, GX-19, CORVax sekä Symvivon ja Entos Pharmaceuticalsin valmistamat DNA-rokotteet ovat myös kliinisissä kokeissa .
DNA-rokote kariesta vastaanKarieksen syy on paikallinen pH - muutos, joka johtuu bakteerien suorittamasta hiilihydraattien käymisestä ( glykolyysistä ) [59] . Wuhan Institute of Virology ( Kiina ) tutkijat ovat kehittäneet DNA-rokotteen yhtä karieksen aiheuttajaa - Streptococcus mutansia - vastaan . Rokote perustuu plasmidiin ja koodaa kahta proteiinia: pintaproteiinia St. mutans PAc ja flagelliini , jotka ovat peräisin Salmonella -bakteerista , joka toimii adjuvanttina [60] . Prekliinisissä tutkimuksissa rokote annettiin nenän kautta laboratoriojyrsijöille, minkä jälkeen eläimillä tarkastettiin immunoglobuliinien G taso veren seerumissa ja erittyvien immunoglobuliinien A taso syljessä . Tutkimusten jälkeen tiedemiehet havaitsivat, että immuuniproteiinien taso sekä veressä että syljessä nousi, mutta mikä tärkeämpää, Streptococcus mutans -pesäkkeiden kasvu hammaskiillessä estyi. Toisin sanoen rokotettujen eläinten hampaat olivat paremmin suojassa karieselta.
Tyypin 1 diabetes mellitukselle on ominaista insuliinia tuottavien beetasolujen häviäminen, jotka sijaitsevat haiman Langerhansin saarekkeissa . Pääsyy beetasolujen häviämiseen on tappaja-T-solujen aiheuttama autoimmuunivaurio [61] . Stanfordin ( USA ) ja Leidenin ( Alankomaat ) yliopistojen tutkijat kehittivät BHT-3021 DNA-rokotteen suojellakseen beetasoluja yliaktiiviselta immuunijärjestelmältä . Rokote on luotu plasmidin pohjalta ja se koodaa insuliini- proinsuliinin esiastetta . Tämä on käänteisvaikutteinen rokote: jos tavanomaisten rokotteiden oletetaan aktivoivan immuunivasteita, niin BHT-3021 päinvastoin neutraloi Langerhansin saarekkeita vastaan suunnattujen T-tappajien sytotoksisen vaikutuksen.
Kliinisten kokeiden ensimmäisessä vaiheessa BHT-3021 osoitti tehokkuutensa 80 ihmisen ryhmässä. Puolet heistä sai lihaksensisäisiä BHT-3021-injektioita seitsemän päivän välein 12 viikon ajan, ja toinen puoli sai lumelääkettä . Tämän ajanjakson päätyttyä rokotteen saaneella ryhmällä havaittiin veren C-peptidien tason nousua, mikä osoitti beetasolujen toiminnan palautumista. Yhdelläkään osallistujalla ei havaittu vakavia sivuvaikutuksia. Rokotteen vaikutus säilyi 2 kuukautta [62] .