Lipidilautat ovat plasmakalvon erityisiä alueita (mikrodomaineja) , jotka on rikastettu glykosfingolipideillä ja kolesterolilla [1] [2] [3] [4] [5] . Nämä paikat koordinoivat soluprosesseja , vaikuttavat kalvon juoksevuuteen , toimivat signalointimolekyylien kokoamisen organisointikeskuksina , säätelevät kalvoproteiinien , reseptorien liikettä ja säätelevät myös hermovälitystä [5] [6] . Lipidilautat ovat rakenteellisempia ja tiheämpiä kuin niitä ympäröivä lipidikaksoiskerros ; samalla he voivat liikkua siinä vapaasti [7] .
Vuoteen 1982 asti uskottiin laajalti, että fosfolipidit ja kalvoproteiinit jakautuivat satunnaisesti solukalvoon - S. J. Singerin ja G. Nicholsonin vuonna 1972 ehdottaman solukalvon rakenteen mosaiikkimallin [6] [8] . Mallissa oletettiin, että kalvoproteiinit "uivat" homogeenisessa lipidimeressä [9] .
Kuitenkin 1970-luvulla A. Stir ja E. Zakman sekä M. J. Karnovsky ja hänen kollegansa osoittivat fysikaalisilla menetelmillä erityisten kalvomikrodomeenien olemassaolon [10] [11] . Näiden mikrodomeenien olemassaolo on selitetty lipidiseosten fysikaalisilla ominaisuuksilla ja organisaatiolla [12] . Vuonna 1974 lämpötilan vaikutuksen havainnointi kalvon käyttäytymiseen viittasi "lipidiklustereiden" olemassaoloon kalvoissa, ja vuonna 1975 havaittiin, että nämä klusterit voivat edustaa "kvasikiteisiä" alueita, jotka sijaitsevat nestemäisemmillä lipidialueilla. Vuonna 1978 röntgensirontaa käyttävät tutkimukset antoivat uuden sysäyksen "klusterien" idean kehitykselle ja mahdollistivat mikrodomeenien määrittelemisen "järjestetymmässä tilassa oleviksi lipideiksi". Vuonna 1982 Karnovsky ja työtoverit muotoilivat kalvon lipididomeenien käsitteen. Heidän tutkimuksensa osoittivat heterogeenisyyden 1,6-difenyyli-1,3,5-heksatrieenimolekyylien fluoresenssin eliniässä , mikä osoittaa useiden lipidifaasien läsnäolon kalvossa [6] . Yhden tyyppisiä tällaisia mikrodomeeneja muodostavat kolesteroli ja sfingolipidit . Ne muodostuvat näiden lipidien eristämisen seurauksena erilliseen faasiin, mikä osoitettiin kokeellisesti [13] . Havaittiin myös, että tällaisia mikrodomeeneja ("lautat") on myös solukalvoissa [14] .
Tämän seurauksena uusi käsite solukalvon rakenteesta muodostui vähitellen, mikä kuvastaa dynaamista uudelleenjärjestelyä korkean tason molekyyliklustereiden muodostumisen myötä [9] . Termiä "lipidilautat" ehdottivat ensimmäisen kerran vuonna 1988 C. Simons ja G. van Meer [15] . He käyttivät termiä ( eng. lipid raft 'lipidilautta') alueille, joissa tiheästi pakattu lipidi kelluu nestemäisemmän fosfolipidin pinnalla [9] . Aluksi lauttojen käsitettä käytettiin selittämään kolesterolin kuljetusta trans - Golgi - laitteesta plasmakalvoon. Tämän idean esittelivät ensimmäisen kerran Simons ja E. Ikonen vuonna 1997 [16] . Vuonna 2006 Keystonen lipidiluuttojen ja solufunktion symposiumissa lipidilautat määriteltiin "pieniksi (10–200 nm), heterogeenisiksi, erittäin dynaamiksi alueiksi, jotka ovat rikastuneet steroleilla ja sfingolipideillä, jotka lokeroivat soluprosesseja. Pienet lautat voivat joskus yhdistyä suuremmiksi proteiini-proteiinivuorovaikutusten kautta." Viime aikoina on julkaistu monia kiistanalaisia artikkeleita lipidilautoista; lipidilauttojen koko ja olemassaoloaika voidaan johtua kiistanalaisten kohtien määrästä (lisätietoja on kohdassa Lipidilauttojen kiistat ).
Tähän mennessä seuraavat lipidilauttoja koskevat kysymykset ovat jääneet vastaamatta [6] :
Yksi tärkeimmistä eroista lipidilauttojen ja plasmakalvon välillä on niiden lipidikoostumus. Tutkimukset ovat osoittaneet, että lipidilautat sisältävät 3-5 kertaa enemmän kolesterolia kuin ympäröivä lipidikaksoiskerros [17] . Lisäksi lipidilautat ovat rikastettuja sfingolipideillä - esimerkiksi sfingomyeliinillä , jonka pitoisuus lipidilautoissa on yleensä 50 % suurempi kuin plasmakalvossa. Lautoissa ei käytännössä ole glyserofosfolipidejä [2] . Lisääntyneen sfingomyeliinipitoisuuden kompensoimiseksi fosfatidyylikoliinin osuutta lipidilautoissa pienennetään, minkä seurauksena myös koliinia sisältävien lipidien prosenttiosuus niissä on lähes 50 % pienempi verrattuna ympäröivään kalvoon. Kolesteroli on ensisijaisesti vuorovaikutuksessa sfingolipidien (vaikkakaan ei vain niiden) kanssa niiden rakenteen ja hiilivetyketjujen kyllästymisasteen vuoksi . Vaikka kaikki lautan fosfolipidit eivät ole täysin tyydyttyneitä, niiden hydrofobiset asyyliryhmät ovat kylläisempiä ja tiheämpiä kuin ympäröivissä kaksikerroksisissa lipideissä [6] .
Kolesteroli toimii dynaamisena "liimana", joka pitää lautan lipidit yhdessä [5] ja täyttää kaikki niiden väliset tyhjiöt. Steroliryhmän jäykästä luonteesta johtuen kolesteroli sijaitsee ensisijaisesti lautoissa, joissa pitkät, tyydyttyneet sfingolipidiasyylipyrstöt voivat muodostaa tiukemmat ja vahvemmat sidokset sen rengasjärjestelmään kuin ympäröivän kaksoiskerroksen lyhyemmät ja usein tyydyttymättömät fosfolipidipyrstöt. Tästä syystä lipidilautat ovat vähemmän nestemäisiä kuin muu kaksoiskerros [2] .
Jotkut tutkijat katsovat, että lauttojen esiintyminen mallikalvoissa johtuu kalvon erottelusta järjestetyksi (Lo-faasi) ja epäjärjestyneeksi (Ld- tai Lα-faasi) nestefaasiksi [18] . Syyt tähän faasien erotteluun ovat epäselviä, mutta niiden sekoittumattomuus ilmeisesti minimoi näiden kahden faasin vapaan energian . On osoitettu, että lipidilautoilla ja ympäröivällä kalvolla on eri paksuus johtuen siitä, että sfingolipidien hiilivetyketjut ovat pidempiä ja suorempia kuin muissa kalvolipideissä [1] . Tämä johtaa siihen, että lauttojen ja muun kaksoiskerroksen hydrofobiset kerrokset eivät liity toisiinsa kahden faasin rajalla. On havaittu, että tämä paksuusero lisää pintajännitystä kahden faasin rajapinnassa, mikä johtaa suurempiin lautoihin pyöristetyillä rajoilla ja minimoi siten lauttojen erillisinä vaiheina pitämisen energiakustannukset. Muut spontaanit tapahtumat, kuten kalvon taipuminen tai pienten lauttojen sulautuminen suurempiin, voivat myös minimoida jännitystä vaiheen rajalla [6] .
Rakenteensa ja ionittomille pesuaineille [2] , kuten Triton X-100: lle tai Brij-98:lle, johtuen lipidilauttoja kutsutaan myös pesuaineeseen liukenemattomiksi glykolipidirikastetuiksi komplekseiksi ( GEM ) tai DIG:iksi [ 19] tai pesuainetta kestäviksi kalvoiksi. (DRM:t) ) . Tätä lipidilauttojen ominaisuutta voidaan käyttää arvioimaan lauttojen miehittämä solupinnan osuus fraktiosta, joka kestää pesuaineen liukenemista . Joissakin tapauksissa se voi olla 50 %. Lauttojen koon epäsuorat mittaukset mahdollistavat karkeasti arvioiden yhden lautan halkaisijan aallonpituudella 50 nm [20] (asiasta on kuitenkin muitakin mielipiteitä, ks. Kiistat lipidilautoista ).
Lipidilautat ovat erittäin runsaasti kahden luokan integraalisia kalvoproteiineja : toinen on ankkuroitu kalvoon kahdella pitkäketjuisella tyydyttyneellä rasvahapolla (kaksi palmitoyyli- tai palmitoyyli- ja myristoyyliryhmää ) , jotka ovat kovalenttisesti liittyneet näihin proteiineihin , ja toinen on glykosyylifosfatidyyli -inositoli (GPI ) -) ankkuri. Lautan proteiinien ja muun kaksoiskerroksen välillä tapahtuu jatkuvaa vaihtoa: kalvoproteiinit pääsevät sisään ja poistuvat lautoista muutamassa sekunnissa . On huomattava, että prosessissa, jossa kaksi kalvoproteiinia ovat vuorovaikutuksessa, niiden samanaikainen läsnäolo samassa lautassa lisää suuresti niiden törmäyksen todennäköisyyttä. Siksi jotkin membraanireseptorit ja signalointiproteiinit erottuvat tarkasti kalvolautoissa, ja signaalin siirto näiden proteiinien kautta voidaan keskeyttää manipulaatioilla, jotka poistavat kolesterolia kalvosta ja tuhoavat lautat; siten lipidilautat osallistuvat moniin solujen signalointireitteihin [20] .
Kahden tyyppisiä lipidilautaita on ehdotettu: tasomaisia (tunnetaan myös ei -caveolaarisina tai glykolipidilautaina ) ja caveolaarisia lipidilautaita. Tasomaiset lipidilautat sijaitsevat plasmakalvon tasolla (eivät muodosta invaginaatioita) eikä niillä ole erottuvia morfologisia piirteitä. Caveolaariset lautat päinvastoin muodostavat pullon muotoisia ulkonemia plasmakalvoon, joka sisältää kaveoliiniproteiinia , joka on osa erityisiä kalvon painaumia - caveolae ; useimmat havaitut lautat ovat tämän tyyppisiä. Caveoliinit ekspressoituvat voimakkaasti aivoissa , hermoston mikrosuonissa , endoteelisoluissa , astrosyyteissä , oligodendrosyyteissä , Schwann - soluissa , selkäydinhermosoluissa ja aivotursohermosoluissa . Tasomaiset lautat sisältävät flotilliiniproteiinia ja niitä löytyy hermosoluista, joista puuttuu caveolae. Molemmilla lautoilla on samanlainen lipidikoostumus (rikastettu kolesterolilla ja sfingolipideillä). Flotilliinilla ja caveoliinilla on kyky värvätä signalointimolekyylejä lipidilauttoihin, joten niillä on tärkeä rooli välittäjäainevälitteisessä signaloinnissa . On ehdotettu, että nämä mikroalueet ovat vastuussa signalointimolekyylien avaruudellisesta organisoinnista siten, että ne helpottavat signaalin siirtoon tarvittavia kineettisesti edullisia vuorovaikutuksia. Nämä samat mikrodomainit kuitenkin erottavat signaalimolekyylit, mikä estää tarpeettomia vuorovaikutuksia ja johtaa signaalin vaimenemiseen [21] .
Termi "signalointi" viittaa mihin tahansa prosessiin, jolla solu muuntaa yhden tyyppisen signaalin tai ärsykkeen toiseksi. Signaali- tai ärsykereitti voi olla yksinkertainen, kuten reseptorimolekyylien tapauksessa. Monimutkaisempi signaalinsiirto sisältää ligandi - reseptorikompleksien osallistumisen moniin solunsisäisiin prosesseihin, kuten tyrosiinikinaasien tai seriini -treoniinikinaasien aiheuttamaan fosforylaatioon [22] . Signaalin lähetyksen spesifisyys ja tarkkuus on oleellista tehokkaalle soluvasteelle ympäristön muutoksiin . Tämä saavutetaan osittain signalointireitteihin osallistuvien proteiinien erilaisella lokalisoinnilla. Plasmakalvossa tämä lokeroittaminen tapahtuu osittain lipidilauttojen avulla [23] .
Yksi tärkeimmistä todisteista lipidilauttojen olemassaolon puolesta on niiden työ alustana, jolle yksittäiset reseptorit keskittyvät aktivoitumisen jälkeen ligandiin sitoutumisen jälkeen [24] . Jos reseptorin aktivaatio tapahtuu itse lipidilautassa, niin lauta suojaa signalointikompleksia ulkoisilta entsyymeiltä , esimerkiksi membraanifosfataaseilta . Yleensä lipidilautat houkuttelevat proteiineja uuteen mikroympäristöön niin, että niiden (de)fosforyloitunut tila voidaan muuttaa paikallisten kinaasien ja fosfataasien vaikutuksesta ja aiheuttaa myöhempiä signalointireaktioita [25] . On osoitettu, että lipidilautat osallistuvat moniin signalointireitteihin, esimerkiksi immunoglobuliini E -signalointireitti , T- ja B- soluantigeenireseptorit , epidermaalinen kasvutekijäreseptori (EGF), insuliinireseptori jne. Joitakin esimerkkejä tällaisista signalointireiteistä on annettu alla.
Immunoglobuliini E:n (IgE) signalointireitin tutkimukset ovat ensimmäistä kertaa vakuuttavasti osoittaneet lipidilauttojen osallistumisen signaalinsiirtoon [26] [27] [28] . Todiste lipidilauttojen osallistumisesta tähän prosessiin on Fc-epsilon- reseptorien (FcεR) heikentynyt liukoisuus Triton X-100 -pesuaineeseen siirtyessä yhdestä tilasta ristisilloittuneeseen tilaan toisen samantyyppisen reseptorin kanssa [26 ] ; gangliosidien ja GPI-ankkuroitujen proteiinien klustereiden muodostuminen, jotka ovat riittävän suuria näkyäkseen fluoresenssimikroskoopilla [29] [30] ; reitin päättyminen, kun pintakolesteroli poistetaan metyyli-β- syklodekstriinillä [31] jne.
Tämän signalointireitin tapahtumien järjestys on seuraava. Ensinnäkin IgE sitoutuu Fc-epsilon-reseptoreihin, jotka sijaitsevat syöttösolujen ja basofiilien plasmamembraaneissa niiden Fc-segmentin kautta. FcεR- tetrameeri koostuu yhdestä α-, yhdestä β- ja kahdesta y-ketjusta [28] . Ensinnäkin yksi FcεR-tetrameeri sitoutuu yhteen IgE-molekyyliin. α-ketju sitoutuu IgE:hen, ja muut kolme ketjua sisältävät immuunireseptorin tyrosiinipohjaiset aktivaatiomotiivit ( ITAM) [ aktivaatiotyrosiinimotiivi . Oligomeerinen antigeeni sitoutuu sitten useisiin IgE-molekyyleihin, jotka ovat jo sitoutuneet FcεR:ään tuolloin, yhdistäen kaksi tai useampia reseptorikompleksia . Tällaisen kytkennän jälkeen kaksinkertaisesti asetyloitu ei-reseptori Src :n kaltainen tyrosiinikinaasi Lyn värvätään fosforyloimaan kahden reseptorin ITAM . Lisäksi Syk - perheen tyrosiinikinaasi sitoutuu ITAM-fosfotyrosiinitähteisiin (Lynin työn tulos) ja käynnistää signalointikaskadin [26] [27] . Syk puolestaan voi aktivoida muita proteiineja, kuten LAT. Sitoutuessaan toisiinsa LAT-proteiinit voivat värvätä muita proteiineja lautalle ja lisäksi vahvistaa (amplifioida) signaalia [32] .
T-soluantigeenireseptori (TCR) on T-lymfosyyttien (T-solujen) pinnalla oleva molekyyli. Se sisältää αβ - heterodimeerin , CD3-(γδε)-kompleksin ja ξ-homodimeerin. α- ja β - alayksiköt sisältävät solunulkoisia sitoutumiskohtia peptideille , jotka ovat luokan I ja II tärkeimmässä histokompatibiliteettikompleksin (MHC) proteiineissa , jotka sijaitsevat antigeenia esittelevien solujen (APC) pinnalla. CD3- ja ξ-alayksiköt sisältävät ITAM - sytoplasmisia motiiveja . Signaalinsiirrossa MHC-molekyylit sitoutuvat TCR:ään yhdistäen kaksi tai useampia reseptoreja yhteen. Tämä reseptorisitoutuminen, kuten IgE-signalointireitillä, värvää kaksinkertaisesti asetyloituja ei-reseptorin Src-kaltaisia tyrosiinikinaaseja ITAM-motiivien fosforyloimiseksi. TCR värvää paitsi tyrosiinikinaasi Lyn, myös Fyn [23] [33] . Tämän jälkeen ZAP-70 -proteiini , joka ei ole mukana IgE-signalointireitissä, sitoutuu fosforyloituihin ITAM:eihin, minkä seurauksena se aktivoituu itse ja aktivoi LAT:n. LAT:n aktivointi vahvistaa signaalia. Toinen ero TCR-signalointireitin ja IgE-signalointireitin välillä on se, että TCR:t aktivoivat Lck -proteiinia , mikä voi johtaa vahvempaan lauttaklusteroitumiseen [34] [35] ja siten lisäksi tehostaa signaalia. Yksi mahdollinen mekanismi tämän reitin alasäätelylle voisi olla sytosolisen kinaasin Csk sitoutuminen lauttaan liittyvään proteiiniin CBP . Tämän jälkeen Csk voi tukahduttaa Src-perheen kinaasien työn fosforylaation kautta [36] .
B-soluantigeenireseptori (BCR) on kalvoon sitoutuneen immunoglobuliinin (mIg) molekyylin ja Igα-Igβ-heterodimeerin kompleksi, joka koostuu kahdesta polypeptidistä , jotka on liitetty toisiinsa disulfidisidoksilla [37] . Sekä Igα että Igβ sisältävät ITAM-motiivin.
BCR-signalointi on samanlaista kuin IgE- ja TCR-signalointi. Yleisesti uskotaan, että sen lisäksi, että ne toimivat BCR:n kautta, lipidilautat voivat olla mukana monissa tapahtumissa, jotka tapahtuvat B-solun pinnalla sen aktivoituessa. Lipidilauttojen toimintoihin B-soluissa kuuluu niiden osallistuminen BCR-signalointireittiin, signaalireittien modulointi rinnakkaisreseptorien toimesta, CD40 - signalointireitit , BCR:ään liittyvien peptidiantigeenien endosytoosi ja niiden myöhempi lataaminen varhaisiin endosomeihin (peptidit, jotka muodostuvat peptidiantigeenin tuhoaminen endosomientsyymien toimesta, näytetään myöhemmin solun pinnalla yhdessä MHC II -molekyylien kanssa ja esitetään T-soluille) [37] .
Jotta virukset , pakolliset solunsisäiset loiset , pääsevät soluun, ovat välttämättömiä viruksen ja plasmakalvon solureseptorien välillä. Todisteita kertyy siitä, että virukset pääsevät soluun tiettyjen kalvon mikrodomeenien kautta, mukaan lukien lipidilautat.
Parhaiten tutkitut esimerkit vaipattomien virusten lipidilauttojen kautta tapahtuvasta solujen tunkeutumisesta ovat apinavirus SV40 ( perhe Papovaviridae ) ja tyypin I echovirus (EV1, perhe Picornaviridae ) [38] [39] .
SV40 käyttää kahta erilaista reseptoria päästäkseen soluun: GM1 gangliosidia , joka sijaitsee lipidilautoissa, ja tyypin I MHC-molekyyliä [38] . SV40:n sitoutuminen MHC-tyypin I molekyyliin aiheuttaa reseptorien klusteroitumista ja uudelleenjakautumista. SV40 voi houkutella lisää onkaloita sytoplasmasta ja jopa aiheuttaa uusien onteloiden muodostumisen sisääntulokohdassa. Viruksen soluun kiinnittymisen laukaisema signalointikaskadi johtaa caveolavälitteiseen viruksen endosytoosiin 20 minuutissa. Joissakin solutyypeissä virus voi päästä kaveosomeihin (kalvosta silmuilevia caveoleja) suoraan päällystämättömistä vesikkeleistä , jotka syntyvät lipidilautoista [39] [40] .
EV1 käyttää α2β1 - integriinia solureseptorinaan . Monet integriiniheterodimeerit voivat sitoutua viruksen kapsidin viereisiin kohtiin. Kuten SV40:n tapauksessa, viruksen kiinnittyminen ja sen sitoutuminen soluun laukaisee integriinimolekyylien klusteroitumisen ja liikkumisen lipidilautoista caveolimaisiin rakenteisiin. Kun kolesteroli poistetaan lipidilautoista, echovirusinfektio ei kehity [38] [39] .
On myös viruksia, jotka käyttävät ei-kaveolaarista lauttavälitteistä endosytoosia, kuten echovirus 11 (EV11, perhe Picornaviridae ), mutta näiden prosessien yksityiskohtaista mekanismia ei ole vielä tutkittu [39] .
Influenssavirukset sitoutuvat solureseptoriin, siaalihappoon , joka on kiinnittynyt glykokonjugaattiin , joka käynnistää endosytoosin. Viruksen siirtymisen jälkeen myöhäisiin endosomeihin alhaisen pH :n vuoksi viruksen hemagglutiniinin (HA) konformaatio muuttuu, minkä jälkeen viruksen lipidivaippa fuusioituu endosomikalvon kanssa ja viruksen ribonukleoproteiini -kompleksit vapautuvat sytoplasma. Tämä tulos laukaistaan protonien virtauksesta viruksen M2- protonikanavan kautta , mikä edellyttää sitoutumista kolesteroliin toimiakseen. Semliki-metsävirus (SFV, perhe Togaviridae ) ja Sindbis-virus (SIN, perhe Togaviridae ) käyttävät kolesterolia ja sfingolipidejä päästäkseen soluun kuoren sisältämän glykoproteiinin vaikutuksesta ja sen jälkeen pääsystä sytoplasmaan [41] . Ihmisen T-lymfotrooppinen virus tyyppi I (HTLV-1, fam. Retroviridae ) pääsee soluun glukoosinkuljettajan 1 ( GLUT1 ) kautta. Ebola-virus ja Marburg-virus käyttävät folaattireseptoria -α (FRα) solureseptorina , joka on GPI-ankkuroitu proteiini. B-hepatiittivirus tunnistaa ihmisen komplementtireseptorin tyypin 2 (CR2 tai CD21). Ihmisen herpesvirus tyyppi 6 (HHV-6) sitoutuu CD46 -reseptoriin solun pinnalla. Kaikki nämä solureseptorit sijaitsevat lipidilautoissa tai liikkuvat sinne infektion aikana .
Sukupuoliteitse tarttuvan ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) on voitettava sellaisten epiteelisolujen este, jotka eivät ilmennä CD4 -reseptoria tai kemokiinireseptoreita (näitä reseptoreita käytetään usein soluun pääsemiseksi) päästäkseen isäntään . Vaihtoehtoinen reseptori HIV-vaipan glykoproteiinille epiteelisoluissa on glykosfingolipidigalaktosyyliseramidi ( GalCer ), jota on runsaasti lipidilautoissa [42] [43] .
Yksi syy lukuisiin kiistaan, joka on syntynyt lipidilauttojen ympärillä, on vaikeus tutkia niitä elävissä soluissa, jotka eivät ole termodynaamisessa tasapainossa [21] . Lipidilautat ovat pieniä mikroalueita, joiden koko on 10–200 nm [6] . Koska niiden koko ylittää valomikroskoopin diffraktiorajan , on erittäin vaikeaa visualisoida lipidilauttoja suoraan. Tällä hetkellä tutkitaan keinotekoisia kalvoja, mutta niiden käytöllä on paljon haittoja. Ensinnäkin keinotekoisten kalvojen proteiinipitoisuus on paljon pienempi kuin biologisissa kalvoissa. Toiseksi on vaikeaa mallintaa biomembraaneissa tapahtuvia kalvo- sytoskeleton -vuorovaikutuksia. Kolmanneksi keinotekoiset kalvot ovat vailla luonnollista epäsymmetriaa, ja niitä on mahdotonta tutkia epätasapainotilassa [6] [44] .
Toinen intensiivisesti käytetty menetelmä lipidilauttojen tutkimiseen on fluoresenssimikroskopia. Esimerkiksi koleratoksiinin B-alayksikköön liittyviä fluoroforeja käytetään laajalti , mikä sitoutuu lauttojen pakolliseen komponenttiin - gangliosidiin GM1. Käytetään myös lipofiilisiä kalvovärejä , jotka joko upotetaan lauttojen ja muun kalvon väliin tai muuttavat fluoresoivia ominaisuuksiaan kalvon vaiheen mukaan. Esimerkki tällaisista väriaineista on usein käytetty laurdan . Lauttoja voidaan myös leimata ekspressoimalla fluoresoivasti leimattuja proteiineja, kuten Lck- GFP .
Kolesterolin sekvestrointi filipiinillä , nystatiinilla ja amfoterisiini B :llä, poistaminen metyyli-B-syklodekstriinillä, sen synteesin estäminen HGM-CoA-reduktaasin estäjillä ovat esimerkkejä tällaisista menetelmistä . Niiden avulla on mahdollista havaita muutoksia välittäjäaineiden signaloinnissa kalvon kolesterolitason laskun myötä [21] .
Korkean resoluution kuvantamista ja matemaattista mallintamista käyttämällä lipidilauttaproteiinien osoitettiin koottavan suuritiheyksisiä nanoklustereita, joiden säde on 5–20 nm. Käyttämällä fluoresenssiresonanssienergian siirron mittausta ( eng. fluorescence resonance energy transfer, FRET ) samojen näytteiden välillä (homo-FRET tai fluoresenssianisotropia ) Sharma ja kollegat päättelivät, että osa (20-40 %) GPI- ankkuroidut proteiinit ovat järjestäytyneet tiheiksi klustereiksi, joiden säde on 4–5 nm [45] . Tällä hetkellä lipidilauttojen pienen koon ja dynaamisen luonteen ongelman ratkaisemiseksi käytetään yhä enemmän yksittäisten hiukkasten ja molekyylien liikkeen havainnointia jäähdytetyillä, herkillä CCD - kameroilla ja kokonaisheijastusmikroskoopilla (TIRF) . Tämän tekniikan avulla on mahdollista saada tietoa hiukkasten kyvystä diffundoitua tutkittavassa kalvossa sekä tunnistaa vyöhykkeitä, joilla on rajoitettu diffuusio ja diffuusioesteet tällä kalvolla [46] .
Myös muita optisia tekniikoita käytetään. Esimerkiksi fluoresenssikorrelaatio- ja ristikorrelaatiospektroskopiaa FCS/FCCS) voidaan käyttää tiedon saamiseksi fluoroforin liikkuvuudesta kalvossa . FRET - tekniikka ( Fluorescence Resonance Energy Transfer ) voi määrittää, milloin fluoroforit ovat lähellä, ja optisia pinsettejä käyttävät tekniikat voivat antaa tietoa kalvon viskositeetista [21] .
Lipidilauttojen tutkimiseen käytetään myös atomivoimamikroskopiaa , pyyhkäisy-ionijohtavaa mikroskopiaa ( engl. Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM) ), bipolarisaatiointerferometriaa , ydinmagneettista resonanssia ; fluoresenssimikroskopia on kuitenkin edelleen hallitseva tekniikka lipidilauttojen tutkimisessa. Tulevaisuudessa superresoluutiomikroskoopin (esim . STED-mikroskoopin [47] ) ja strukturoidun valaistusmikroskoopin eri muodot toivottavasti auttavat voittamaan diffraktiorajoituksen aiheuttamat ongelmat .
Lisäksi lauttojen kanssa työskentelyssä käytetään entsyymikytkettyä immunosorbenttimääritystä (ELISA), Western blottausta ja fluoresenssiaktivoitua solulajittelua (FACS) [48] [49] [3] .
Lauttojen roolia solunsisäisessä signaloinnissa, aineenvaihdunnassa ja solurakenteen ylläpidossa ei ole vielä täysin määritelty, huolimatta monista eri menetelmillä tehdyistä kokeista, ja jopa lipidilauttojen olemassaolo kyseenalaistetaan [50] .
Seuraavat väitteet vastustavat lipidilauttojen olemassaoloa:
Viimeisen kohdan ensimmäinen kumoaminen on, että lautan Lo-faasi on tiheämpi sfingolipidi- ja kolesterolimolekyylien välisten molekyylien välisten vetysidosten vuoksi, eikä näitä sidoksia muodostu muualla [51] .
Toinen argumentti lipidilauttojen olemassaoloa vastaan johtuu lipidilauttojen tuhoamisen tehokkuudesta tutkimuksessa. Kolesterolin poistamisella lautoista voi olla kielteisiä vaikutuksia lauttojen toimintaa koskevien lisätulosten luotettavuuteen [52] . Useimmat tutkijat käyttivät kovia menetelmiä kolesterolin poistamiseksi kalvoista, mikä tuhosi paitsi lauttojen, myös toisen kalvon fosfolipidin , fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatin (PI(4,5)P 2 ). Tällä fosfolipidillä on tärkeä rooli sytoskeleton säätelyssä [53] , ja sen tuhoutuminen voi johtaa tuloksiin, jotka yleensä selitetään kolesterolin poistumalla, mukaan lukien proteiinien lateraalinen diffuusio kalvossa [54] . Koska yleisimmin käytetyt menetelmät tuhoavat sekä lautat että PI(4,5)P 2 :n, kolesterolin poiston vaikutusta tiettyyn prosessiin ei voida katsoa pelkästään lauttojen tuhoamiseksi, sillä se voi vaikuttaa moniin ei-lauttaprosesseihin. Lopuksi, vaikka nyt oletetaankin, että lautat ovat jotenkin kiinnittyneinä proteiineihin, jotkut tutkijat uskovat, että proteiinit voidaan värvätä lautalle vain vuorovaikutuksessa kalvon sisään piilotettujen lipidiasyylipyrstöjen kanssa, ei muuten [55] .
| Solukalvon rakenteet | |
|---|---|
| Kalvon lipidit | |
| Kalvoproteiinit |
|
| Muut |
|